REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Cisteinske peptidaze imajo vlogo virulenčnih dejavnikov pri mnogih praživalih, med drugim tudi pri parazitu Trypanosoma cruzi. Sekveniranje genoma tega organizma je nakazalo obstoj več novih družin cisteinskih peptidaz. Osredotočili smo se na dve družini: metakaspaze iz klana CD in avtofagine (oziroma Atg4 proteaze) iz klana CA. V svojem prejšnjem delu smo identificirali dva gene iz družine metakaspaz v T. cruzi: metakaspazo-3 in metakaspazo-5. Gen za metakaspazo-3 je prisoten v 16 kopijah na haploidni genom, zdaj pa smo ugotovili, da se dve tandemski ponovitvi teh kopij nahajata na različnih kromosomih. Ugotovili smo tudi, da se metakaspaza-3 izraža v vseh glavnih razvojnih stadijih T. cruzi, kar potrjuje dejstvo, da serumi skoraj vseh pacientov s kronično Chagasovo boleznijo vsebujejo protitelesa proti metakaspazi-3. V topni obliki nam je uspelo izraziti metakaspazo-3 s skrajšanim aminoterminalnim koncem. Ta protein smo uporabili za merjenje proteolitične aktivnosti s kombinatoričnimi knjižnicami fluorescenčnih sintetičnih substratov, vendar aktivnosti nismo zaznali. S poliklonskimi protitelesi smo ugotovili, da se metakaspazi premakneta iz citosola v jedro v procesu s svežim človeškim serumom inducirane programirane celične smrti epimastigotov in da morda aktivno sodelujeta pri tem procesu v T. cruzi.
V genomu T. cruzi smo identificirali dva gena iz družine avtofaginov, TcATG4.1 (avtofagin-1) in TcATG4.2 (avtofagin-2). Prav tako smo identificirali dva predvidena substrata avtofaginov, homologa ubikvitinu podobnega gena ATG8, TcATG8.1 in TcATG8.2. Vse štiri gene smo izrazili v E. coli in proteine izolirali. Oba, TcAtg4.1 in TcAtg4.2 sta aktivni cisteinski peptidazi, čeprav samo TcAtg4.1 učinkovito procesira TcAtg8.1 in TcAtg8.2. Eksperimenti rekonstitucije pri kvasovkah so pokazali, da TcATG4.1 in TcATG4.2 lahko nadomestita gen ATG4 iz Saccharomyces cerevisiae in vzpostavita avtofagijo. V sevu z izbitim genom ScATG8 je to lahko storil le TcATG8.1, TcATG8.2 pa ne. V nadaljevanju smo s poliklonskimi protitelesi proti TcAtg8.1 v imunofluorescenčnih študijah v T. cruzi opazili, da se ta protein premakne v membrane avtofagosomov med podaljšanim stradanjem epimastigotov. Na podlagi teh rezultatov lahko sklepamo, da je TcATG8.1 funkcijski homolog gena ATG8 iz S. cerevisiae in sesalskega MAP1 LC3 in sodeluje pri tvorbi in rasti avtofagosomov. Pokazali smo tudi, da se aktivnost avtofaginov izraža v vseh razvojnih stadijih T. cruzi, kar nakazuje, da avtofagija na bazalni ravni v tem organizmu poteka ves čas.