Doktorska disertacija
Vloga in pomen cisteinskih katepsinov pri različnih modelih programirane celične smrti
Ogledi: 8 | Prenosi: 6
Povzetek
Programirana celična smrt je aktiven proces, pri katerem večcelični organizmi odstranijo odvečne ali
škodljive celice, kar je potrebno za normalen razvoj organizma. Obstaja več oblik programirane celične
smrti, med katerimi je najbolj raziskana apoptoza. Značilne morfološke in biokemijske lastnosti umirajoče
celice so posledica aktivnosti cisteinskih proteaz iz družine kaspaz. V splošnem obstajata dve glavni poti
sprožitve kaspazne kaskade: zunanja pot preko receptorjev smrti in notranja oz. mitohondrijska pot. Za
zunanjo pot je značilno, da proapoptotski dražljaj iz zunanjosti celice sproži oligomerizacijo membranskih
receptorjev smrti (družina TNF). Posledica oligomerizacije receptorjev je tvorba kompleksa DISC na
citosolni strani celične membrane. Nanj se veže sprožitvena prokaspaza-8 ali -10, ki oligomerizira in se
tako aktivira. Za notranjo pot je značilno, da proapoptotski signali znotraj celice povzročijo, da se citokrom
c sprosti iz mitohondrijev v citosol, kjer skupaj z Apaf-1 in ATP tvori kompleks apoptosom, na katerega se
nato veže še prokaspaza-9. Zunanjo in notranjo pot apoptoze povezuje proapoptotski protein Bid, iz družine
Bcl-2, ki ga lahko cepijo kaspaza-8, kalpaini, grancim B in lizosomske proteaze.
Vedno več je dokazov, ki poleg kaspaz potrjujejo tudi vlogo cisteinskih proteaz oziroma katepsinov v
procesu apoptoze. Do destabilizacije lizosomskih membran in vivo prihaja predvsem med staranjem in pri
različnih bolezenskih stanjih, kot so nevrodegenerativne bolezni in ishemija. Zmanjšanje stabilnosti
lizosomskih membran in vitro pa lahko povzročijo sfingozin, oksidativni stres, aktivacija receptorjev smrti
ter lizosomotropne snovi, kot je L-levcil-L-levcil-metilni ester (LeuLeuOMe). Kljub temu, da je primarna
funkcija lizosomskih proteaz razgradnja proteinov v lizosomih, so katepsini aktivni tudi zunaj njih. Ko so
enkrat v citosolu, lahko sprožijo apoptozo preko notranje poti. Destabilizacija lizosomov in vitro in in vivo
je povzročila cepitev Bida s katepsini, čemur so sledili sproščanje citokroma c in aktivacija kaspaze-3.
Vendar pa cepitev Bida s katepsini ni nujno edina pot sprožitve apoptoze, saj lahko katepsini cepijo ali
razgrajujejo tudi antiapoptotske proteine iz družine Bcl-2. V citosolu lahko cisteinski proteazi katepsin B in
L ter aspartatna proteaza katepsin D sprožijo permeabilizacijo zunanje mitohondrijske membrane, čemur
sledi od kaspaz-odvisna ali od kaspaz-neodvisna programirana celična smrt.
Naš prvi namen dela je bil natančneje raziskati mehanizem sprožitve apoptoze z neposredno
destabilizacijo lizosomov z lizosomotropno kemikalijo LeuLeuOMe na človeški celični liniji HaCaT, ter
pojasniti vlogo in pomen katepsinov na tem modelu celične smrti. Pri sprožitvi apoptoze z neposredno
destabilizacijo lizosomov smo pokazali, da pride do vrste morfoloških in biokemijskih sprememb značilnih
za apoptozo, kot so izpostavitev fosfatidilserina na zunanjo stran celične membrane, povečana aktivnost
kaspaze-3, poškodba mitohondrijske membrane ter cepitev molekule PARP. Pokazali smo tudi, da se pri
apoptozi sproženi z LeuLeuOMe lizosomi poškodujejo pred mitohondriji. Cisteinski katepsini, ki se
sprostijo iz lizosoma v citosol, pa lahko cepijo Bid ali razgradijo antiapoptotski protein Bcl-xL. Inhibitor
lizosomskih cisteinskih proteaz E-64d je cepitev Bida in razgradnjo proteina Bcl-xL preprečil, pankaspazni
inhibitor z-VAD-fmk pa na ta dva procesa ni imel vpliva.
Tudi po aktivaciji receptorjev smrti prihaja do destabilizacije lizosomske membrane in posledičnega
prehajanja katepsinov v citosol. Natančni mehanizmi sprožitve celične smrti, zaradi destabilizacije
lizosomskih membran preko receptorjev smrti, še vedno niso popolnoma pojasnjeni. Nekateri avtorji trdijo,
da je destabilizacija lizosomov zgodnji dogodek v apoptozi, temu pa sledi destabilizacija mitohondrijev in
aktivacija kaspaz. Naše zadnje ugotovitve na mišjih primarnih dermalnih fibroblastih pa kažejo, da je po
aktivaciji receptorja Fas destabilizacija lizosomov lahko tudi sekundarni dogodek oziroma do nje pride po
poškodbi mitohondrijev. Zato je bil naš naslednji namen dela natančneje raziskati mehanizem sprožitve
destabilizacije lizosomske membrane pri apoptozi sproženi s fiziološkim sprožilcem apoptoze TNF-α na
mišjih embrionalnih fibroblastih divjega tipa in mišjih embrionalnih fibroblastih z izbitim genom za
katepsin B ali katepsin L. Ugotovili smo, da je pri apoptozi sproženi s TNF-α/CHX poškodba lizosomske
membrane sekundarni dogodek, saj je prišlo najprej do poškodbe mitohondrijske membrane, temu pa je
sledila poškodba lizosomov. Ugotovili smo tudi, da so za poškodbo lizosomske membrane odgovorne
reaktivne kisikove zvrsti, ki nastanejo po poškodbi mitohondrijske membrane. To smo potrdili z uporabo
odstranjevalcev reaktivnih kisikovih zvrsti, kot sta butiliran hidroksianizol in TEMPOL, ter z uporabo
kelatorja železovih ionov desferoksamina. V nadaljevanju smo ugotovili, da katepsina B in L na našem
celičnem modelu najverjetneje predstavljata le ojačitveno zanko med lizosomi in mitohondriji. In
nenazadnje smo tudi pokazali, da je protein Bid substrat za katepsine, saj smo zaznali manj cepljene oblike
v celicah z izbitim genom za katepsin B ali katepsin L v primerjavi s celicami divjega tipa.