REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Raziskovali smo možne mehanizme poškodb, ki jih povzročajo kisikovi radikali na dveh vrstah bakterij. Izbrali smo po eno standardno ATCC vrsto Gram pozitivnih bakterij (Staphylococcus aureus) in Gram negativnih bakterij (Escherichia coli). Bakterije smo vzgojili po standardiziranem postopku, ki ga je predpisal proizvajalec, in fiksirali na treh različni vrstah podlag: Al foliji, visoko orientiranem grafitu in visoko poliranih silicijevih rezinah. V slednjih primerih je bila hrapavost podlag manjša od 1 nm. Podlage z bakterijami smo izpostavili kisikovim radikalom v dveh različnih okoljih: 1 – induktivno sklopljeni RF plazmi z gostoto nevtralnih atomov 1x1022 m-3 in gostoto ionov 1.4x1016 m-3 in 2 – porazelektritvenemu delu kisikove plazme, v katerem je bila gostota kisikovih atomov 3.5x1021 m-3.
Čas obdelave vzorcev v plazmi in porazelektritvenemu delu smo spreminjali med 1 in 500 s. Takoj po obdelavi s kisikovimi radikali smo vzorce preiskovali z dvema dopolnjujočima se metodama: vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) in mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Z obema metodama smo ugotovili, da je tako na površini bakterij kot tudi v prostoru med bakterijami znotraj posameznih dvodimenzionalnih skupkov, prisotna kapsula. Število bakterij v posameznem skupku je bilo značilno manjše od 10. Slike, ki smo jih dobili z metodo SEM, pri čemer smo uporabili nizkoenergijske primarne elektrone, so pokazale, da je debelina kapsule okoli 100 nm za bakterije S. aureus in 150 nm za E. coli.
Prvi opazni pojav pri interakciji kisikovih radikalov z našimi vzorci je poškodovanje kapsule. Tako SEM kot AFM slike so pokazale, da se je kapsula močno poškodovala že po nekaj sekundah obdelave. Del kapsule je razpadel na majhne kapljice, ki so ostale razpršene okoli bakterij. Kljub temu, da smo opazili nekaj takšnih kapljic tudi v okolici bakterij, ki niso bile izpostavljene delovanju radikalov, lahko sklepamo, da je opaženi pojav razpršitve kapsule specifična lastnost obdelave s kisikovimi radikali, saj je število kapljic po kratkotrajni obdelavi bistveno večje kot pred obdelavo. Pojav smo razložili kot posledico dramatičnega povečanja površinske energije kapsule po kratkotrajni obdelavi s kisikovimi radikali, saj le ti povzročijo funkcionalizacijo površine z zelo polarnimi s kisikom bogatimi funkcionalnimi skupinami. Kapljice kakor tudi del kapsule, ki je ostala na površini bakterij, kisikovi radikali povsem odstranijo pri podaljšani obdelavi vzorcev.
Takoj po tem, ko so radikali odstranili večji del kapsule, smo opazili strukturirano površino celične stene. AFM rezultati so jasno pokazali, da je celična stena sestavljena iz posameznih segmentov. Ugotovili smo tudi, da kisikovi radikali povzročajo večanje hrapavosti celične stene in trganje posameznih segmentov, dokler v nekem trenutku ni stena tako poškodovana, da razpade na množico posameznih segmentov, ki so raztreseni po okolici bakterij. O tovrstnem razpadu celične stene relevantna literatura ne poroča, saj je v nasprotju s klasičnimi opisi interakcije plazme ali kateregakoli drugega reagenta z bakterijsko celično steno.
Podaljšana obdelava z radikali povzroči postopno oksidacijo segmentov iz celične stene, dokler popolnoma ne izginejo s površine podlag. Po tem, ko je celična stena močno poškodovana, lahko radikali reagirajo tudi s citoplazmo. Pri tem smo opazili razliko v strukturi citoplazme E. coli in S. aureus. V primeru E. coli se citoplazma razlije v okolico bakterije takoj po tem, ko celična stena razpade. Ta pojav je skladen s klasično teorijo zgradbe bakterijske citoplazme, ki je predstavljena kot želatinasta napol tekoča snov. V primeru S. aureus pa se citoplazma ne izlije v okolico, ampak obdrži svojo prvotno kroglasto obliko tudi po tem, ko je celična stena že popolnoma uničena. Navedeni rezultat potrjuje novo teorijo o zgradbi bakterijske citoplazme, ki jo je leta 2001 predlagal Jones s sodelavci. Po njegovi teoriji ima citoplazma Bacillus subtilis nekakno ogrodje, ki ga imenujemo citoskeleton. Naši rezultati jasno kažejo, da ima citoplazma v bakterijah S. aureus tovrstno ogrodje, ki je tako togo, da obdrži obliko tudi v odsotnosti celične stene.
Zelo dolga obdelava obeh vrst bakterij s kisikovimi radikali privede do domala popolne oksidacije organskega materiala, iz katerega so sestavljene bakterije, tako da na podlagah ostane samo še pepel.
Poznavaje gostote toka kisikovih radikalov na površino bakterij omogoča izračun potrebne doze radikalov za dosego posameznih stopenj degradacije bakterij. Za odstranitev kapsule na bakteriji S. aureus je potrebna doza radikalov 1.6x1025m-2 v primeru izpostave v plazmi in 6.6x1025 m-2 v primeru porazelektritvenega dela. Za Gram negativno bakterijo E. coli so ustrezne vrednosti nekoliko nižje in sicer 0.8x1025m-2 za obdelavo v plazmi in 1.4x1025m-2 za porazelektritveni del. Doza radikalov, ki je potrebna za uničenje celične stene bakterij S. aureus, je 7.1x1025m-2 v plazmi in 1.9x1026m-2 v porazelektritvenem delu. Ustrezne vrednosti za E. coli so 1.6x1025m-2 in 1x1026m-2. Dozo radikalov, ki je potrebna za popolno oksidacijo bakterij, tako da na površini podlage ostane le še pepel, je težko oceniti, saj ni mogoče natančno in nedvoumno definirati, kdaj je ves organski material povsem oksidiran. Kljub temu lahko navedemo vsaj približne ocene, ki so naslednje: za S. aureus 1.9x1026m-2 v plazmi in več kot 2.7x1026m-2 v porazelektritvenem delu ter za E. coli 9.4x1025m-2 v plazmi in več kot 2.7x1026m-2 v porazelektritvenem delu.
Na osnovi naših rezultatov smo predlagali nov model tridimenzionalne organiziranosti peptidoglikana v celični steni bakterije E. coli. V našem modelu se nahaja pepdidoglikan v obliki dobro definiranih gradnikov, ki so tanke ploščice ovalne ali okrogle oblike. Gradniki so v celični steni naloženi tako, da prekrivajo spodnje gradnike, podobno kot ribje luske ali strešniki na strehi.