REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Proteaze so encimi, ki so odgovorni za ragradnjo peptidnih vezi v proteinskih oziroma peptidnih substratih,
ki lahko ključno vplivajo na številne biološke procese. Zaradi tega mora biti proteolizna aktivnost proteaz
natačno kontrolirana in uravnana. Nepravilno delovanje proteaz tako vodi do številnih bolezni. Bolezni
sklepov delimo na vnetna, mednje sodi revmatoidni artritis (RA), in degenerativna (osteoartroza, OA)
obolenja, kjer zaradi nepravilnega delovanja proteaz pride do razgradnje sklepnega hrustanca in kosti v
obolelem sklepu. Proteaze, ki sodelujejo pri teh procesih, spadajo v skupini metaloproteaz zunajceličnega
matriksa (MMP) in lizosomskih cisteinskih proteaz (katepsinov). Pri nastanku obolenj imajo pomembno
vlogo tudi provnetni citokini, kot so interlevkin-1β, interlevkin-6 in dejavnik tumorske nekroze alfa (TNF-α),
ki vplivajo na raven izražanja genov proteaz, ki sodelujejo pri procesih razgradnje. Prav tako do sedaj ni
bilo narejene primerjalne študije ravni izražanja izbranih proteaz in njihovih proteoliznih aktivnosti med
bolniki z RA in OA. Namen prvega dela doktorskega dela je bil določiti raven izražanja proteinov različnih
provnetnih citokinov (IL-1β, IL-6 in TNF-α), izbranih cisteinskih katepsinov (katepsina B in S) in
metaloproteaz zunajceličnega matriksa (MMP-1, -3 in -13) kot tudi njihove proteolitske aktivnosti v
vzorcih sinovijske tekočine bolnikov obolelih z RA ali OA. Tako smo pokazali, da sta oba izbrana
cisteinska katepsina in metaloproteaze zunajceličnega matriksa-1, -3 in 13 prisotni v vzorcih sinovijske
tekočine bolnikov in da je njihov raven izražanja statistično značilno povišan pri bolnikih z RA.
Podrobnejša analiza je pokazala, da ima med izbranimi cisteinskimi katepsini najpomembnejšo vlogo
katepsin S, ki tudi pomembno vpliva na delovanje imunskega sistema. Ti rezultati tako nakazujejo
pomembno vlogo cisteinskih katepsinov pri vnetnem odzivu, ki se razvije pri RA. Poleg izbranih proteaz pa
smo v vseh vzorcih sinovijske tekočine določili tudi interlevkin-6, s statistično značilno razliko pri bolnikih
z RA v primerjavi z OA, kar kaže pomembno vlogo tega provnetnega citokina pri stimulaciji izražanja teh
proteaz med vnetnim odzivom.
Citrulinacija je posttranslacijska modifikacija proteinov, kjer se argininski aminokislinski preostanek
spremeni v citrulin, ki predstavlja nenaravni aminokislinski preostanek. Reakcijo katalizira peptidilarginin
deiminaza (PAD). Predvideva se, da se lahko s citrulinacijo spremeni imunogenost tarčnega proteina, ki
zaradi spremenjenih aminokislinskih preostankov sproži avtoimunski odziv. Skladno s to idejo so pri
bolnikih z RA našli tako citrulinirane proteine kot tudi protitelesa proti citruliniranim proteinom. Poleg tega
pa so protitelesa proti citruliniranim proteinom postala zanesljiv diagnostični kazalec za ugotavljanje RA. S
citrulinacijo lahko vplivamo na razgradnjo tarčnega proteina, saj s spremembo pozitivno nabitih argininskih
aminokislinskih preostankov vplivamo na intra- in intermolekularne interakcije. Namen drugega dela
doktorskega dela je pokazati, da so lahko citrulinirani proteini zunajceličnega matriksa bolj dovzetni za
razgradnjo z izbranimi proteazami, za katere je bilo že pokazano, da so udeležene pri razvoju in
napredovanju RA. Kolagena tipa I in tipa II, kot glavni sestavini kostnine in sklepnega hrustanca, tako
predstavljata modelna proteina za študijo vpliva citrulinacije na razgradnjo z izbranimi proteazami.
Uspešno smo citrulinirali želatino kolagena tipa I pri in vitro pogojih pri 37 °C, kar smo tudi potrdili z
uporabo protiteles proti citruliniranim peptidom. Pokazali smo, da je citrulinirana oblika želatine kolagena
tipa I bolj dovzetna za razgradnjo s cisteinskimi katepsini B, K in S kot necitrulinirana oblika. Teh
rezultatov nismo mogli potrditi pri razgradnji oziroma procesiranju obeh oblik želatine tipa I z izbranima
metaloproteazama zunajceličnega matriksa-1 in -3. Nativne oblike kolagena tipa II, pod temi
eksperimentalnimi pogoji, nismo uspeli citrulinirati.