REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Toksičnost, mobilnost in biološka dostopnost aluminija (Al) so odvisne od kemijskih zvrsti v kateri se Al
nahaja. Da bi razumeli toksičnost in transport Al v človeškem telesu je potrebno identificirati in
kvantificirati Al zvrsti (speciacije) prisotne v humanem serumu. To je vodilo do razvoja občutljivih in
selektivnih analiznih metod za zanesljivo speciacijo Al v serumu. Namen mojega raziskovalnega dela je bil
razvoj analiznih metod za identifikacijo visokomolekularnih (VM) in nizkomolekularnih (NM) Al zvrsti v
humanem serumu. Za separacijo omenjenih Al kompleksov sem uporabila različne anionsko izmenjalne
monolitne nosilce in nosilce s stacionarno fazo na osnovi polnil s krogljicami ter velikostno izključitvene
kolone. Koncentracijo Al v ločenih zvrsteh sem določila z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno
plazmo (ICPMS). Identifikacijo ligandov na katere se veže Al sem izvedla s tekočinsko kromatografijo
ultra ločljivosti z masno spektrometrijo z ionizacijo na osnovi razprševanja v električnem polju (UPLCESI-
MS) in nativno gelsko elektroforezo (SDS-PAGE).
Za speciacijo Al v serumu z znano dodano množino Al (dodatek do 300 ng mL-1 Al) sem uporabila
anionsko-izmenjalne monolitne nosilce, ki temeljijo na konvektivnem prenosu snovi (CIM®) v kombinaciji
z velikostno izključitveno kromatografijo (VIK) in ICPMS. Separacijo proteinov sem izvedla na šibkem
anionskem-izmenjalnem CIM® dietilaminoetil (DEAE) monolitnem disku. Eksperimenti so pokazali, da se
90 ± 3 % Al v serumu z znano dodano množino Al eluira pod vrhom transferina (Tf). Predlagan postopek
za speciacijo Al v serumu odstrani VM-Al zvrsti in omogoča zanesljivo dolocitev koncentracije in sestave
Al vezanega na proteine, kadar je koncentracija Al v serumu večja od 5 ng mL-1. V primerjavi z ostalimi
kromatografskimi kolonami je CIM® monolitni DEAE disk omogočal hitrejšo separacijo in enostavnejše
rokovanje med postopkom čiščenja. Razvit analizni postopek omogoča zanesljivo določitev koncentracije
in sestave VM-Al zvrsti v vzorcu seruma z dodatkom Al.
Z uporabo CIM® monolitne kolone sem razvila analizni postopek za speciacijo Al v humanem serumu,
ki vsebuje normalne koncentracije Al. Separacijo proteinov sem izvedla na šibko anionsko-izmenjalni
CIM® DEAE monolitni koloni. Ločene Al zvrsti sem sledila z ICPMS. Ugotovila sem, da je 91 ± 7 % Al v
humanem serumu vezanega na Tf. Tf sem identificirala ne samo na osnovi retenzijskega volumna temveč
tudi z UPLC-ESI-MS in SDS-PAGE. Da bi rešili problem kontaminacije, moramo uporaba učinkovite
postopke čiščenja eluentov in kromatografskih nosilcev. Učinkovito čiščenje je bistvenega pomena pri
speciaciji Al na ekstremno nizkih koncentracijskih nivojih. Ponovljivost merjenja, ki sem jo testirala s
šestimi zaporednimi separacijami seruma brez dodatka Al je bila ± 8.6 %. Meji zaznavnosti in
kvantifikacije (3s in 10s slepega vzorca) sta bili 0.15 and 0.49 ng mL-1 Al vezanega na Tf. To je prvo
poročanje o kvantitativni in zanesljivi speciaciji Al v humanem serumu na normalnih koncentracijskih
nivojih.
Razvila sem nov analizni postopek za učinkovito, zanesljivo in hitro separacijo proteinov od NM zvrsti
v serumu. HiTrap velikostno izključitvena kolona omogoča separacijo VM od NM zvrsti v 10 min. Za
elucijo sem uporabila Tris-HCl pufer. VM-Al zvrsti so se eluirale v prvih 5 min, medtem ko so se NM-Al
zvrsti eluirale med 5 in 10 min. VM and NM zvrsti sem zbrala v dve 5 mL frakciji. Speciacijo proteinskega
vrha sem izvedla na anionsko-izmenjalnem monolitnem disku v direktni povezavi z ICPMS. NM frakcijo
sem injicirala na anionsko-izmenjalno hitro proteinsko tekočinsko kolono (FPLC). Eksperimentalno sem
dokazala, da je 93 ± 4 % Al v humanem serumu vezanega na Tf, medtem ko je preostali Al vezan na NM
zvrsti. Citrat, ki je ena glavnih NM-Al zvrsti v serumu, sem identificirala v NMM frakciji z UPLC-ESIMS.
Predlagani analizni postopki za speciacijo VM-Al in NM-Al zvrsti v kombinaciji z ostalimi
eksperimentalnimi in teoreticnimi tehnikami omogočajo razumevanje vloge, porazdelitve in toksičnosti Al
v človeškem telesu. Hitrost in zanesljivost razvitega analiznega postopka sta bistveni prednosti, ki
omogočata preučevanje kinetike vezave Al na serumski transferin.