REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Naravne celice ubijalke (celice NK) in citotoksični limfociti T (CTL) prepoznajo z virusi okužene ali maligno spremenjenje celice (tarčne celice) in jih uničijo preko dveh neodvisnih mehanizmov. Smrt tarčnih celic se lahko sproži na dva načina: preko receptorjev smrti ali s sprostitvijo sekretornih granul. Sekretorne granule se zberejo na mestu kontakta med efektorsko celico (celico NK ali CTL) in tarčno celico, kjer se formira imunološka sinapsa. V imunološki sinapsi se membrana sekretornih granul zlije z membrano efektorske celice, vsebina sekretornih granul pa se sprosti v imunološko sinapso. Sekretorne granule imajo nizek pH in membransko sestavo, ki je značilna za lizosome. Vsebujejo perforin in serinske proteaze grancime, kot tudi različne lizosomske proteine (Lamp 1 in 2, CD63, katepsin B, D, in L).
Perforin je od kalcija odvisen protein, ki tvori pore na plazemski membrani in omogoči vstop grancimov v citoplazmo tarčnih celic, kjer nato grancimi cepijo določene substrate ter sprožijo celično smrt. Miši z izbitim genom za perforin imajo zmanjšano sposobnost obrambe pred bakterijskimi in virusnimi okužbami, ne zavračajo transplantiranih tumorjev ter s staranjem spontano razvijejo limfome B-celic.
V sekretornih granula se s C-terminalnega dela perforina odcepi 12–20 aminokislin. Cepitev lahko preprečimo z inkubacijo z inhibitorjem cisteinskih katepsinov E-64, inhibitorjem cisteinskih in serinskim proteinaz leupeptinom ter amonijevim kloridom, kar kaže na potencialno vlogo cisteinskih katepsinov v tem procesu. Nizek pH sekretornih granul (pH 5,1–5,5) je ugoden za interakcije med perforinom in proteoglikani.
Z našimi študijami smo želeli pojasniti vlogo cisteinskih katepsinov pri regulaciji procesiranja in degradacije perforina. Naše začetne in vitro študije so pokazale, da katepsini B, K, L in S cepijo in inaktivirajo perforin. Z uporabo specifičnih protiteles, ki prepoznajo C-terminalni del perforina, smo pokazali, da katepsin L preferenčno odcepi C-terminalni del perforina in vitro.
Pri inkubacijah človeških celic NK (NK-92, YT 5, KHGY1) z inhibitorjema cisteinskih katepsinov E-64d in L1 smo pokazali, da ta inhibitorja blokirata procesiranje perforina. Pri študijah procesiranja perforina z inhibitorjema cisteinskih katepsinov E-64d in L1 in inhibitorjem N-glikozilacije, tunikanamicinom, pa smo pokazali, da katepsini procesirajo C-terminalni del perforina, ki je glikoziliran. Nato smo pokazali, da inhibicija cisteinskih katepsinov z E-64d in L1 v človeških celicah NK in primarnih mišjih CTL zmanjša njihovo učinkovitost pri ubijanju tarčnih celic. S kolokalizacijskimi študijami na celicah YT in celicah NK-92 smo potrdili, da se perforin nahaja v sekretornih granulah in ne v endoplazemskem retikulumu. Poleg tega smo ugotovili, da je perforin delno kolokaliziran s katepsinom L, ne pa tudi s katepsinoma B in S. Ključno vlogo katepsina L smo želeli potrditi tudi z poskusi na celicah NK in CTL katepsin L ničelnih miši. Dokazali smo razlike v procesiranju perforina pri katepsin L ničelnih miših in miših divjega tipa. Inhibitorji cisteinskih katepsinov so preprečili procesiranje perforina. CTL in celice NK katepsin L ničelnih miši, pa so pobijale tarčne celice enako učinkovito ali celo bolje kot celice NK in CTL, izolirane iz miši divjega tipa. Inhibicija cisteinskih katepsinov z E-64d in L1 je zmanjšala učinkovitost CTL katepsin L ničelnih miši pri pobijanju tarčnih celic, vendar ni vplivala na učinkovitost celic NK katepsin L ničelnih miši pri pobijanju tarčnih celic. Sklepali smo, da so granularno vezani katepsini nujni za procesiranje perforina v aktivno obliko, da je katepsin L pomemben, vendar ni edini, ki lahko sodeluje v tem procesu, temveč so lahko udeleženi tudi ostali katepsini.
V nasprotju z našimi pričakovanji, so celice NK in CTL katepsin L ničelnih miši prve dni po diferencijacji ubijale tarčne celice bolj učinkovito kot kontrolne celice NK, izolirane iz miši divjega tipa. Ker ima katepsin L tudi številne funkcije v jedru celice, sklepamo, da je učinek povezan z jedernimi funkcijami katepsina L. Pokazali smo, da je aktivnost katepsina L v jedru regulirana tudi z endogenimi inhibitorji: stefinom B (Čeru et al., 2010) in serpinom A3G (Konjar et al., 2010).