REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Interakcije med proteini so ključni dogodki v vseh življenjskih procesih, zato je njihova karakterizacija
ključna v razumevanju fiziologije in z njo povezanih procesov. Za razumevanja dinamičnih procesov v
celicah ni pomembno samo razumevanje končnih stanj, kjer so molekule vezane v komplekse, ampak tudi
način približevanje molekul in orientacije pred tvorbo le-tega.
Z raziskovanjem močnih interakcij med proteazami in njihovimi inhibitorji smo poskušali pridobiti
vpogled v nastanek kompleksov in njihove lastnosti v odvisnosti od medsebojne razdalje. Interakcije v
kompleksih smo proučevali s pomočjo proteinske kristalografije in encimske kinetike, določene na klasičen
način in s pomočjo površinske plazmonske resonance. Z mikroskopijo na atomsko silo smo določili
razdaljo med potencialnim minimumom in prehodnim stanjem v Bellovem modelu, ki opisuje disociacijo
dveh molekul. Dodatne informacije o tej razdalji smo pridobili z kinetiko tvorbe kompleksov med
inaktiviranimi katepsini in stefinom A. Kinetični podatki, združeni z določenimi kristalnimi strukturami in
izračunanimi modeli so nam omogočili vpogled v energijsko bilanco interakcije v odvisnosti od razdalje.
Interakcije med proučevanimi encimi in njihovimi inhibitorji se pretežno dogajajo, ko je njihova
medsebojna oddaljenost pod 10 Å (s pomočjo mikroskopije na atomsko silo smo določili 8.5 Å). V grobem
približku lahko povzamemo, da je energije tvorbe kompleksa v linearni odvisnosti od razdalje med obema
molekulama. Ti podatki so v pomoč tudi pri razumevanju končnega stanja, o katerem največ pove
proteinska kristalografija. Več določenih kristalnih struktur nam poleg teh podatkov daje tudi vpogled v
mehanizem tvorbe kompleksa.
Določili smo tridimenzionalne strukture kompleksov med reduciranim katepsinom V in stefinom A,
med katepsinoma L in V, blokiranima z MMTS, in stefinom A ter strukturo kompleksa med eksopeptidazo
katepsinom B in stefinom A. Te strukture so pokazale, da modifikacija aktivnega cisteina zmotijo nativno
vezavo, ne preprečijo pa nastanek kompleksa. Prav tako lahko opazimo, da je vezava N-terminalnega konca
in prve zanke v stefinu A v aktivno mesto katepsinom dobro definirana, dočim pa je druga zanka precej
fleksibilna. Prav tako smo pokazali, da lahko izključitvena zanka v katepsinu B zavzame različne
konformacije, ki so odvisne od vrste inhibitorja, ki se veže v aktivno mesto. V nasprotju s stefini, ki za
inhibicijo uporabljajo vezavo z tremi zankami, se klitocipin veže v aktivno mesto s pomočjo le dveh zank.
Kristalna struktura katepsina V v kompleksu s klitocipinom nam je omogočila, da smo na atomarnem
nivoju pojasnili prej še neznan mehanizem inhibicije cistenskih proteaz s mikocipini. Pri vezavi klitocipina
je najbolj zanimiva sprememba konformacije peptidne vezi med glicinoma, ki nastane pred ali sočasno z
vezavo inhibitorja v aktivno mesto.