REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Tvorba netopnih proteinskih agregatov v različnih tkivih in celicah je značilen pojav za številna
človeška obolenja, imenovana amiloidoze. Prisotnost napačno zvitih in agregiranih proteinov v možganih
spada med glavne karakteristike nevrodegenerativnih obolenj, med katere spadajo Alzheimerjeva,
Parkinsonova, Huntingtonova bolezen, prionske bolezni ter mnoge druge. Vzroki za nastanek proteinskih
agregatov, njihov celostni učinek na celice in biokemijski procesi, ki se ob njihovem nastanku sprožijo, še
niso dobro pojasnjeni. Ravno zaradi slabega poznavanja mehanizmov nevrodegenerativnih obolenj je za
njihovo zdravljenje na razpolago zgolj malo učinkovitih zdravil, pa še ta ne odpravljajo vzrokov bolezni,
pač pa le lajšajo njihove simptome.
Napačno zviti proteini se pogosto združujejo v strukturno urejene amiloidne fibrile. Amiloidni fibrili so
sestavljeni iz vzporednih, vzdolžno prepletenih β trakov, ki so postavljeni pravokotno na os fibrila in se
povezujejo v dolge, nitaste strukture. So zelo stabilni, odporni na delovanje proteaz in jih lahko specifično
obarvamo z barviloma ThT ali Kongo Rdeče. Amiloidni fibrili lahko tvorijo različni proteini brez nekih
skupnih strukturnih lastnosti, niti na nivoju primarne, sekundarne ali terciarne strukture.
Namen našega dela je bil preučevanje mehanizma tvorjenja proteinskih agregatov človeškega stefina B
in ugotoviti učinek prisotnih agregatov stefina B na delovanje evkariontske celice.
Na področju preučevanja napačno zvitih proteinov so se uveljavile tri pomembnejše hipoteze. Prva
zagovarja teorijo, da lahko tvori amiloidne fibrile prav vsak protein, če le izberemo zanj primerne pogoje.
Druga hipoteza predpostavlja, da imajo agregati proteinov, ki niso udeleženi v nobeni (do sedaj) znani
bolezni, enak citotoksičen učinek kot agregati proteinov, ki so bili identificirani pri patogenih stanjih. Tretja
hipoteza pa izpostavlja dejstvo, da so najbolj citotoksični prefibrilarni oligomerni agregati, ki vodijo do
nastanka zrelih fibril in ne sami fibrili, kot so raziskovalci sprva mislili.
Za preučevanje amiloidne fibrilacije smo kot modelni protein izbrali človeški stefin B. Glede na tri
postavljene hipoteze izpolnjuje stefin B vse pogoje za vlogo modelnega proteina, poleg tega so bili
zvijanje, stabilnost in proces amiloidne fibrilacije stefina B tekom zadnjih let že temeljito preučeni.
Eksperimente smo razdelili na dva dela. In vitro študije so zajemale postavitev osnovnega modela
mehanizma amiloidne fibrilacije stefina B ter opazovanje vplivov mikro-okolja, natančneje vpliva
prisotnosti bakrovih ionov ter medsebojni vpliv dveh amiloidogenih proteinov, peptida amiloid-beta ter
stefina B. Pri in vivo študijah pa smo sledili celičnemu odzivu kvasnih celic Saccharomyces cerevisiae na
ravni celotnega genoma ob povečanem izražanju stefina B znotraj celic.
Na osnovi kinetičnih, strukturnih in morfoloških podatkov smo predlagali osnoven model mehanizma
amiloidne fibrilacije stefina B. Pri študijah kinetike smo merili temperaturno in koncentracijsko odvisnost
hitrosti rasti fibril. Model vključuje tvorbo prepletenih dimer iz monomer, ki se združijo bodisi v
oligomerno »stransko pot« bodisi v agregacijsko jedro, kjer mora priti do zaporednih Ni = 64
konformacijskih sprememb, preden lahko pride do rasti protofibril v fibrile. Globalno prileganje
matematičnih enačb kinetični shemi ter uporaba Arrheniusove zakonitosti sta nam razkrila tri energetske
bariere. Najvišja energija aktivacije (95 ± 5 kcal mol-1) odraža delno razvitje monomer pri tvorbi
prepletenih dimer, nukleacijski korak s konformacijsko pretvorbo Ni =64 ireverzibilnih prehodov naj bi
zahteval energijo aktivacije 55 ± 4 kcal mol-1, medtem ko smo tretjo energijsko bariero 27 ± 5 kcal mol-1,
značilno za rast in podaljševanje fibril (glajenje fibril), pripisali konformacijskih spremembam prolinske
izomerizacije iz trans v cis obliko.
Pri študiju vpliva bakrovih ionov na amiloidno fibrilacijo stefina B smo se oprli na dve dejstvi. Izkazalo
se je, da je stefin B vezal bakrove ione z visoko afiniteto, kar ni veljalo za stefin A, ki je sicer njegov
homolog s primerljivo strukturo. Do vezave ni prišlo niti pri tetramerni obliki stefina B, moč vezave pa je z
nižanjem pH vrednosti padala. Glede na to, da so količine kovinski ionov (med njimi tudi bakrovih) v
možganih pri nevrodegenerativnih obolenjih zelo povečane, nas je zanimal vpliv bakrovih ionov na
patogen proces nevrodegenerativnih obolenj - amiloidno fibrilacijo. Pri ugotavljanju vpliva prisotnosti
bakrovih ionov na proces amiloidne fibrilacije stefina B smo pokazali, da so bakrovi ioni popolnoma
inhibirali rast fibril dimerne oblike stefina B, nastanek fibril stefina B divjega tipa so inhibirali z nižjo
jakostjo, do inhibicije pa je prišlo celo pri tetramerni obliki stefina B, ki sicer afinitete do bakrovih ionov ni
kazala. Interakcija bakrovi ionov s stefinom B je na novo odprla vprašanje njegove celične funkcije, saj bi
lahko bil stefin B eden od proteinov, ki in vivo vežejo baker in tako vzdržujejo izjemno pomembno in
občutljivo homeostazo bakra v možganih.
Peptid amiloid-beta je glavni patološki protein pri Alzheimerjevi bolezni. Značilnost Alzheimerjeve
bolezni so zunajcelični plaki agregiranih proteinov. Znotraj teh senilnih plakov so (med drugim) odkrili
tudi prisotnost stefinov. Glede na to, da je bila že prikazana vloga cistatina C pri Alzheimerjevi bolezni,
smo želeli podrobneje preučiti vlogo cistatinov (tudi stefina B) pri tej bolezni in vzeli pod drobnogled
interakcijo stefina B s peptidom amiloid-beta. Uspeli smo pokazati koncentracijsko odvisno vezavo stefina
B in peptida amiloid-beta, do katere pa je prišlo samo pri določenih oligomernih stanjih stefina B. Tako sta
le stefin B Y31, ki je večinoma v dimerni obliki, in tetramerna oblika stefina B E31 (divji tip) vezala peptid
amiloid-beta in posledično inhibirala njegovo fibrilacijo. S tem se je stefin B uvrstil med vezavne proteine,
ki vežejo peptid amiloid-beta in vitro ter, sodeč po začetnih eksperimentih, tudi in vivo. Predlagali smo, da
bi stefin B lahko imel funkcijo "amaterskega" šaperona, kot je že bilo predlagano za npr. gelsolin,
apolipoproteine in heparin-sulfat-proteoglikane.
Delovanje amiloidogenega proteina stefina B smo, poleg preučevanj v in vitro pogojih, želeli opazovati
tudi v in vivo sistemu. Gen za izražanje stefina B smo pod inducibilnim promotorjem vstavili v genom
kvasovke Saccharomyces cerevisiae ter ob sproženi ekspresiji stefina B opazovali celični odziv kvasnih
celic na ravni celotnega genoma. Osredotočili smo se na spremljanje vzorcev genskega izražanja s pomočjo
tehnike mikromrež in določitev genskih interakcij med vstavljenim amiloidogenim stefinom B in
posamičnim genom kvasovke S. cerevisiae (z izjemo esencialnih genov). Prisotnost stefina B E31 v
kvasnih celicah smo dokazali s pomočjo imunodetekcije. Opazili smo, da je med celicami prišlo do različne
stopnje izražanja stefina B E31. Protein je bil pri 40 % vseh celic prisoten v velikih količinah, pri 60 %
celic pa je bil signal izraženega stefina B komaj zaznaven. Imunofluorescenca je potrdila prisotnost
tvorjenih agregatov znotraj kvasnih celic, vendar pri manjšem številu celic. Pri določitvi genskih interakcij
med stefinom B E31 in posameznimi geni kvasovke S. cerevisiae smo ugotovili, da stefin B ni sprožil
značilno pomembnih procesov znotraj celic, niti nismo pri analizi transkriptoma odkrili značilno
pomembnih metabolnih poti. Očitno integriran stefin B E31, kljub prisotnim agregatom, kvasnim celic ni
povzročil izrazite škode, pa tudi ne koristi. Tako bi v prihodnjih študijah lahko preverili vpliv bolj
agresivne mutante (z bolj izraženo nagnjenostjo k agregaciji) stefina B na delovanje celic kvasovk S.
cerevisiae.