REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Plazemska glutamat karboksipeptidaza (PGCP) je metalopeptidaza, ki hidrolizira
dipeptide na proste aminokisline. V študijah žleze ščitnice je bilo ugotovljeno, da encim
sodeluje pri sproščanju hormona tiroksina (T4) iz tiroglobulina (Tg). Iz primarne
strukture človeškega PGCP je napovedanih pet potencialnih N-glikozilacijskih mest.
V okviru doktorskega dela smo preučevali vpliv sprememb N-glikozilacije na
lokalizacijo encima PGCP in s tem na delovanje izven celice. Zaradi fiziološke
pomembnosti smo raziskovali vlogo PGCP pri izvenceličnem sproščanju T4.
V študiji smo uporabili mestno specifično mutagenezo na cDNK PGCP tako, da smo
mutirali asparagin na mestih zaporedja 61, 179, 353, 356 in 396 v alanin. S tem smo
preprečili N-glikozilacijo. Pripravili smo devet mutantov z zelenim fuzijskim proteinom,
začenši z enojnimi ter prešli na mutiranje vseh petih potencialnih glikozilacijskih mest.
Ekspresija transficiranih celičnih linij HEK 293 in FRTL-5 je prikazala, da se po
izražanju usmerijo v vezikle, z uporabo imunoloških metod pa smo ugotovili, da se
proteini izločajo v medij.
Rekombinantni PGCP smo pripravili v bakulovirusnem sistemu ter ga uporabili za
karakterizacijo. Rekombinantni encim smo očistili in dobili 8 mg proteina na 1l gojišča.
Pokazali smo, da ima PGCP hibriden ali kompleksen tip N-glikozilacije. Po čiščenju smo
ugotovili, da je izolirani encim aktiven. Encim je cepil dipeptid Ser-Met, v prisotnosti
EDTA, DTPA in bestatina pa je bila njegova aktivnost inhibirana. Pri delovanju encima
smo opazili tudi aktivacijski učinek kloridnega iona.
Eksopeptidaza katepsin C odceplja dipeptide z N-terminalnega dela substratov. PGCP
hidrolizira dipeptide na posamezne aminokisline. Podganje ščitnične celice (FRTL-5)
smo uporabili za določevanje znotrajcelične lokalizacije obeh encimov z imunološkimi
metodami. Encima sta kolokalizirala s PDI, markerjem za endoplazemski retikulum, in z
Golgin-97, markerjem za Golgijev aparat, deloma pa z LAMP-2, markerjem lizosomov.
Študije na ščitničnih celicah so dokazale, da sta bila PGCP in katepsin C tudi izločena
v medij. Izločanje aktivnega katepsina C je bilo stimulirano s hormoni TSH, inzulinom
in/ali somatostatinom. Aktivnost katepsina C smo merili v gojišču s specifičnim
substratom Gly-Phe-4βMNA.
Analiza deglikozilacije je pokazala, da ima izločen PGCP hibriden oz. kompleksen tip
N-glikozilacije. Pri deglikozilaciji PGCP iz lizata smo opazili minimalno zmanjšanje
molske mase, kar nakazuje na vsebnost visoko manozne glikozilacije.
Ugotovili smo, da so hormoni TSH, inzulin in somatostatin FRTL-5 celicam povzročili
zvišanje izražanja N-acetilglukozaminil transferaze I (GnT1), ki je odgovorna za začetek
hibridne ali kompleksne glikozilacije.
Pri skupnem delovanju PGCP in katepsina C smo dokazali, da omogočata časovno
linearno sproščanje hormona tiroksina iz tiroglogulina. In vitro poskusi cepitve prašičjega
Tg s katepsinom C so povzročili skrajšanje N-terminalnega dela molekule za 12
aminokislin. Med odstranjenimi dipeptidi je bil tudi dipeptid s tiroksinom. Katepsin C ni
cepil novonastalega N-terminalni dela, ki se je začel z Arg-Pro-. Z uporabo visokotlačne
kromatografije z obrnjenima fazama smo dokazali, da so produkti cepitev katepsina C
nadalje hidrolizirani s PGCP.
Ob dodatku prašičjega Tg v gojišče celic FRTL-5 se je sprostil tiroksin, sproščanje pa
je bilo zmanjšano ob dodatku sintetičnih inhibitorjev cisteinskih in metalo proteinaz.
S pripravo imunohistokemijskih rezin mišjih ščitnic, ki so prikazale prisotnost PGCP
in katepsina C v epitelijskih celicah foliklov, smo pokazali smiselnost podatkov
pridobljenih iz poskusov opravljenih na celičnih kulturah ter iz in vitro študij.