REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Prisotnost steroidnih estrogenov v okolju je podrobneje preučevana v zadnjih dveh desetletjih, predvsem zaradi njihovega potencialnega negativnega vpliva na organizme že pri zelo nizkih koncentracijah (ng/L). Za določanje steroidnih estrogenov in celotnega estrogenega potenciala se uporabljajo kompleksne in občutljive kemijske in biološke metode.
V prvem delu doktorske disertacije sem optimiziral pripravo vzorca in kemijsko analizo s plinsko kromatografijo in masno selektivnim detektorjem (GC-MSD). Celotno metodo sem optimiziral, validiral in uporabil na okoljskih vzorcih. V ta namen sem iztok iz bolnišnice ter dotok in iztok iz čistilne naprave (ČN) vzorčil v šestih zaporednih dneh in v vzorcih določil koncentracije naravnih - estron (E1), 17β-estradiol (E2), estriol (E3), in umetnih - 17α-etinilestradiol (EE2) - steroidnih estrogenov. Spojine sem ekstrahiral iz vzorcev, jih čistil s silikagelom in na koncu analiziral z GC-MSD. Dnevne koncentracije, ki sem jih določil v iztoku iz bolnice, so bile od 8,6 do 31,3 ng/L za E1, pod mejo zaznave (<LOD) do 4,2 ng/L za E2 in 6,4 to 385,5 ng/L za E3. V dotoku na ČN so bile koncentracije E1 od 18,9 do 49,7 ng/L, E2 od 2,4 to 12,7 ng/L, in za E3 od pod mejo kvantifikacije (<LOQ) do 63,9 ng/L. Na iztokih sem, v primerjavi z dotoki, določil nižje vrednosti: <LOD do 7,1 ng/L za E1, <LOQ za E2 in <LOD do 5,2 ng/L za E3. EE2 sem zaznal samo v enem vzorcu. Razmerje E1:E2:E3 v vzorcih iztoka iz bolnišnice (1:0,1:9,4) je bilo primerljivo z razmerjem v urinu nosečih žensk (1:0,3:20), kar nakazuje, da bi le-te lahko bile najverjetnejši vir steroidnih estrogenov. Razmerje v vzorcih dotoka na ČN je bilo podobno razmerju, ki ga najdemo v urinu moških in žensk, ki niso noseče. Izračunal sem tudi estradiolske ekvivalente (EEQ), ki so dosegali vrednosti 33,4 ng(EEQ)/L v bolnišničnih iztokih, 22,4 ng(EEQ)/L v dotoku na ČN in 1,7 ng(EEQ)/L v iztoku iz ČN. Stopnja odstranitve steroidnih estrogenov tekom obdelave odpadne vode na ČN je bila do 99 %, v nekaterih primerih pa sem določil stopnje odstranitve tudi pod 80 %, oziroma celo pod 40 %. Prav tako sem zaznal variabilnost stopnje odstranitve ob različnih dnevih v tednu (39 % do 99 %). Pri tem je velik delež estrogenega potenciala prispeval E3, ki sem ga prepoznal kot enega najpomembnejših steroidnih estrogenov, saj je v bolnišnični odpadni vodi prispeval tudi do 92 % celotnega estrogenega potenciala, na dotokih in iztokih iz ČN pa 37 % oziroma 46 %. Povzetek rezultatov kaže, da so bolnišnice pomemben vir steroidnih estrogenov. Vendar pa koncentracije, tako v bolnišnični odpadni vodi, kot v dotoku in iztoku ČN, niso konstantne, kot npr. za E3, ki smo ga zaznali v koncentracijah od 6.4 do 385.5 ng/L. Zaradi tega je potrebna posebna pozornost pri načrtovanju vzorčenja za zagotavljanje pravilne presoje vpliva steroidnih estrogenov na okolje, hkrati pa je v raziskave potrebno vključiti manj aktivne spojine, kot je npr. E3.
V drugem delu sem v raziskavo vključil test estrogenosti ER-Calux®, ki sem ga združil z že obstoječo metodo kemijske analize (GC-MSD) v enotno metodo. Združena metoda omogoča sočasno določanje koncentracij steroidnih estrogenov in celotne estrogenosti v okoljskih vzorcih. Pri tem sem dimetil sulfoksid (DMSO), ki se običajno uporablja v ER-Calux® testu zamenjal z etil acetatom, topilom, ki je bolj primeren za uporabo v kemijski analizi in ne vpliva na delovanje ER-Calux® testa. Združeno metodo sem najprej testiral s čistimi standardi steroidnih estrogenov, kjer so rezultati GC-MSD in ER-Calux® testa pokazali dobro ujemanje (r2=0,96; α=0,94). Podobne rezultate sem dobil tudi, ko sem metodo testiral z mešanico standardov in ekstraktov odpadne vode (r2=0,92, α=1,02). Uporabnost združene metode sem nato potrdil s testiranjem realnih okoljskih vzorcev dotokov in iztokov iz ČN (r2=0,93; α=0,99). Glavna prednost, ki jo prinaša združena metoda je, da lahko vzorec na preprost način hkrati testiramo tako z GC-MSD, kot tudi z ER-Calux® testom, s čimer se zmanjšata tudi porabljen čas in material. Združeno metodo lahko uporabljamo kot celoto, ali pa v zaporedju, kjer ER-Calux® test uporabimo kot presejalni test pred kemijsko analizo.
Tako za GC-MSD, kot tudi za ER-Calux® test je vzorce potrebno pripraviti s časovno zamudnimi metodami. Zato sem se v zadnjem delu raziskave osredotočil na poenostavljenje in skrajšanje postopka priprave vzorca in posledično na potrebno prilagoditev ER-Calux® testa. Test sem prilagodil tako, da sem lahko testiral okoljske vzorce brez predhodne ekstrakcije (NE-(ER-Calux®) test). To metodo sem primerjal z ER-Calux® testom in kemijsko analizo GC-MSD. Z vsemi metodami sem testiral vodovodno in odpadno vodo z dodanimi standardi. Primerjava NE-(ER-Calux®) testa z drugima metodama je pokazala, da med odzivi pri posameznih metodah ni statistično signifikantnih razlik. Metode sem nato primerjal tudi na odpadnih vodah iz sedmih ČN (dotok in iztok), ter v rečnih vzorcih, kamor se iztekajo vode iz ČN (nad in pod mestom iztoka). Razen nekaterih izjem, so rezultati pokazali, da je estrogeni potencial vzorcev določen z NE-(ER-Calux®) testom nekoliko višji kot z ER-Calux® testom. Rezultati NE-(ER-Calux®) testa so bili na iztokih iz ČN višji za 2,1-32,4 ng(EEQ)/L, na iztokih iz ČN za 0,8-14,2 ng(EEQ)/L in 1,7-12,3 ng(EEQ)/L višji v rečnih vzorcih pod mestom iztoka. Rezultati pridobljeni z biološkima metodama so se ujemali z rezultati kemijske analize. NE-(ER-Calux®) test sem uporabil tudi za določitev variabilnosti estrogenega potenciala na ČN znotraj enega dneva. Dotoke in iztoke na ČN sem 12 h vzorčil na vsako uro in jih analiziral v roku 24 h. Rezultati so pokazali, da estrogeni potencial v dotokih na ČN narašča od jutra (12,9 ng(EEQ)/L) in doseže najvišjo vrednost ob 16:00 (40,0 ng(EEQ)/L). Povprečna vrednost vseh urnih vzorcev (27,1 ng(EEQ)/L) je bila primerljiva z estrogenim potencialom časovno povprečnega vzorca (25,2 ng(EEQ)/L), ki pa predstavlja le 62 % najvišje izmerjene vrednosti v dnevu. Zmanjšanje estrogenosti med postopkom obdelave odpadne vode je bilo 92 % do 98 %, kar se ujema s časovno povprečnim vzorcem (96 %). Z raziskavo sem dokazal variabilnost estrogenega potenciala znotraj posameznega dne. Ti rezultati lahko pripomorejo k boljšemu razumevanju kroženja in transporta steroidnih estrogenov v okolju. Pomembno vlogo pri raziskavi je igrala sposobnost NE-(ER-Calux®) testa za določanje estrogenosti neposredno v izhodnih vzorcih, brez zamudne priprave vzorca. Ker ekstrakcija vzorca ni bila potrebna, sem čas, potreben za pripravo vzorca, zmanjšal za 95 %. To je še posebej pomembno v okoljskih študijah, kjer je v kratkem času potrebno analizirali veliko število vzorcev, hkrati pa lahko ta test uporabimo kot presejalni test v nadzornih meritvah.