Doktorska disertacija
Vloga in pomen cisteinskih katepsinov pri celični smrti inducirani z ligandom TRAIL
Ogledi: 7 | Prenosi: 8
Povzetek
Apoptoza je proces, s katerim večcelični organizmi varno odstranjujejo odvečne,
postarane ali poškodovane celice. Med apoptozo se vsebina celice ne sprosti v medcelični
prostor, zato ne pride do vnetnega odziva. Napake v uravnavanju procesa apoptoze lahko
privedejo do raznih patoloških stanj, tako zaradi prekomerne kot zaradi nezadostne
apoptoze. Apoptoza se lahko sproži po dveh glavnih poteh, zunanji in notranji. Pri
notranji poti proapoptotski signali povzročijo sproščanje citokroma c iz mitohondrijev v
citosol, ki skupaj s proteinom Apaf-1 oblikuje kompleks apoptosom, na katerem se
aktivira kaspaza 9. Zunanja pot potrebuje proapoptotski signal iz zunanjosti celice.
Vezava ligandov smrti na membranske receptorje smrti sproži tvorbo kompleksa DISC
(death inducing signaling complex), na katerem se aktivirata kaspazi 8 ali 10. Na koncu
obeh poti se aktivirata izvršitveni kaspazi 3 in 7.
Cisteinske proteaze kaspaze so ključni encimi pri apoptozi. Vedno več pa je dokazov,
ki govorijo o pomembnosti lizosomskih proteaz pri apoptozi, predvsem cisteinskih
katepsinov. Destabilizacija lizosomov pri različnih bolezenskih stanjih povzroči
sproščanje lizosomske vsebine v citosol. Tako sproščeni katepsini lahko sprožijo
apoptozo z aktivacijo notranje poti. S cepitvijo molekule Bid in razgradnjo
antiapoptotskih proteinov družine Bcl-2 pripomorejo k permeabilizaciji zunanje
mitohondrijske membrane in sproščanja citokroma c v citosol. Poleg tega z razgradnjo
antiapototskega proteina XIAP katepsini vplivajo na aktivnost kaspaz tudi v kasnejših
fazah apoptoze.
Natančen mehanizem destabilizacije lizosomske membrane pri aktivaciji zunanje poti
apoptoze še ni natančno pojasnjen. Nekateri avtorji trdijo, da je poškodba lizosomov
zgodnji dogodek v apoptozi in da katepsini že v začetnih fazah pripomorejo pri
destabilizaciji mitohondrijske membrane. Naše nedavne študije pa kažejo, da je po
sprožitvi apoptoze z ligandoma Fas in TNF-alfa destabilizacija lizosomov pozni dogodek.
Namen našega dela je bil raziskati mehanizem destabilizacije lizosomske membrane pri
apoptozi sproženi z ligandom TRAIL pri mišjih embrionalnih fibroblastih in humanih
tumorskih celičnih linijah.
Pri mišjih embrionalnih fibroblastih smo ugotovili, da je apoptoza sprožena z ligandom
TRAIL od kaspaz odvisen proces, pri čemer se najprej poškoduje mitohondrijska
membrana in je poškodba lizosomov sekundarni dogodek. Odsotnost katepsina B je
vplivala na delež apoptotskih celic, ni pa vplivala na stabilnost mitohondrijske ali
lizosomske membrane. Katepsini najverjetneje predstavljajo ojačitveno zanko med obema
organeloma, niso pa pomembni pri začetni sprožitvi poškodb mitohondrijev. V naši
raziskavi smo kot povezavo med poškodbami obeh organelov identificirali reaktivne
kisikove zvrsti (ROS). ROS se sprostijo iz poškodovanih mitohondrijev in so odgovorne
za nadaljnje poškodbe tako drugih mitohondrijev kot lizosomov. Z uporabo
odstranjevalca ROS Tempola in kelatorja železovih ionov desferoksamina smo potrdili,
da je sprostitev citokroma c iz mitohondrijev pogojena tudi z oksidacijo kardiolipina.
Z uporabo inhibitorjev katepsinov smo tudi pri humanih tumorskih celičnih linijah
pokazali, da katepsini ne vplivajo na potek apoptoze, ki jo sproži ligand TRAIL. Po
poškodbi lizosomov se katepsini sprostijo v citosol, kjer tudi ohranijo svojo aktivnost,
vendar z inhibicijo njihove aktivnosti ne preprečimo poškodb mitohondrijev in tudi ne
apoptoze.
Oksidativni stres lahko povzroči poškodbe lizosomske membrane in prehajanje
katepsinov v citosol. Med tarčami katepsinov so tudi sirtuini, proteini, ki sodelujejo pri
preusmeritvi avtofagije k apoptozi. Z uporabo rekombinantnih katepsinov B, L in S smo
dokazali in vitro cepitve sirtuinov.
Poznavanje molekularnega mehanizma poteka apoptoze je nepogrešljivo pri
načrtovanju uporabe inhibitorjev proteaz pri zdravljenju tumorskih bolezni. Z modelom
apoptoze sprožene z ligandom TRAIL pri mišjih embrionalnih fibroblastih in več
humanih tumorskih celičnih linijah smo natančneje opisali časovni potek apoptoze s
poudarkom na poškodbah mitohondrijev in lizosomov ter vpletenosti cisteinskih proteaz
kaspaz in katepsinov.