REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Proteinsko zvijanje opisuje prehod med neurejeno in urejeno strukturo, v kateri polipeptidna veriga doseže nativno, tri-dimenzionalno obliko s pripadajočo funkcijo. Podrobno razumevanje gonilnih sil, ki sodelujejo pri proteinskem zvijanju, kot so konformacijske preference aminokislinskega ostanka, vpliv sosednjega aminokislinskega ostanka in vpliv topila, ostajajo pomemben izziv, s katerim bi dobili vpogled v energijske stopnje proteinskega zvijanja. Poznavanje dejavnikov, ki prispevajo h konformacijski stabilnosti aminokislinskih ostankov, bi omogočilo vpogled v molekularne osnove nezvitega stanja, kot tudi v začetne dogodke, ki se zgodijo na poti proteinskega zvijanja oziroma napačnega zvijanja proteinov. Za študijo konformacijskih preferenc glavne peptidne verige nezvitega peptida smo uporabili kratke peptide alaninov. Sprememba okolja peptida je vplivala na težnjo tvorbe intra- ali intermolekularnie vodikove vezi. Z uporabo IR, Ramanske, VCD, NMR in UV-CD spektroskopije smo določili porazdelitev konformacij v vodnem in nevodnem okolju. Opazili smo visoko občutljivost amidne III regije, kjer imajo posamezne konformacije karakteristične frekvence trakov in karakteristične oblike vrhov v primeru VCD spektra. Pri alanin dipeptidu v vodi je bila z DFT računanjem ugotovljena stabilizacija PII konformacije z usmerjenimi vodnimi mostički med C=O in NH peptidnimi skupinami. V primeru polarnih topil se je ujemanje med eksperimentalnimi in izračunanimi spektri močno izboljšalo z dodatkom eksplicitnih molekul topila. Pri kratkih peptidih alanina je bilo ugotovljeno dobro ujemanje med stabilizacijo konformacije s topilom in modelom elektrostatskega senčenja, kjer je konformacija močno odvisna od lokalne elektrostatske energije in senčenjem le-te s topilom. Z daljšanjem peptidne verige je bil opažen efekt sosednjega aminokislinskega ostanka, ki je zmanjšal PII populacijo in ojačal ugodne elektrostatske interakcije glavne verige kratih peptidov alanina.
Napačno zvijanje proteina lahko vodi do agregacije proteinov, kar lahko posledično privede do nastanka amiloidnih fibril, ki povzročajo smrtonosne bolezni. Mehanizem napačnega zvijanja proteinov in njihova agregacija v fibrile še ni povsem razjasnjena. Spektroskopske raziskave konformacijskih sprememb, ki se zgodijo tekom fibrilacije, pojasnjujejo odnos med spektralnimi lastnostmi in reakcijskimi koordinatami proteinskega zvijanja. Z uporabo infrardeče spektroskopije smo razvili vpogled v sekundarno strukturo peptida tako, da smo določili asignacijo amidnih trakov različnih konformacij modelnega peptida poli-L-lizina (PLL). PLL v vodi pri nizkih pH vrednostih v večini zavzame PII in β strukture, medtem ko se pri višjih pH vrednostih in nizkih temperaturah pojavi karakteristični vrh za α-helično konformacijo. Višje temperature inducirajo tvorbo β struktur, ki pa so hkrati tudi komponente amiloidnih fibril. Za določevanje asignacije vrhov v infrardečih spektrih so bila uporabljena različna topila, ki selektivno stabilizirajo določeno konformacijo. Med vsemi topili je le etilen glikol spodbudil nastanek PII-heliksa, kar nakazuje na drugačno razlago PII stabilizacije, kot je bila predvidena do sedaj, in ni vezana na prisotnost vode ali nabitih stranskih skupin. S pridobljeno asignacijo spektralnih vrhov smo sledili mehanizmu fibrilacije PLL-ja. Uporabili smo diferenčno spektroskopijo, s katero smo dobili informacije o strukturnih spremembah med toplotno inducirano PLL fibrilacijo. Spektralne spremembe pod temperaturo prehoda so bile pripisane taljenju α-heliksa. Vrh, ki predstavlja PII-heliks, je začel izgubljati intenziteto malo pred začetkom PLL fibrilacije. To nakazuje na njegovo vlogo intermediata v procesu fibrilacije. Na kinetiko PLL fibrilacije smo vplivali z dodanim promotorjem PLL fibrilacije, kot je sol NaClO4, ali inhibitorjem PLL fibrilacije, kot so DPPA+DPPC vezikli. Sol NaClO4 zniža temperaturo prehoda iz α-helične strukture do β-ploskev fibril za 10 °C. Mehanizem delovanja soli smo razložili s stabilizacijo PII-heliksa. Dodatek DPPA+DPPC veziklov je stabiliziral α-heliks in PII-heliks PLL-ja. Ta interakcija je hkrati destabilizirala vezikle. Po temperaturi taljenja veziklov se je pojavil spektralni vrh, karakterističen za β-trak, kateremu je sledil vrh, karakterističen za agregirane β-ploskve. Predlagali smo mehanizem nastanka PLL amiloidnih fibril, kjer se α-heliks stali v PII-heliks, kateremu sledi tvorba β-traku, ki je gradnik β-ploskve. Pokazali smo, da je diferenčna infrardeča spektroskopija primerna metoda za pridobivanje strukturnih lastnosti intermediatov tekom procesa fibrilacije.
Terapevtski pomen za pridobivanje poglobljenega znanja o fibrilaciji inzulina v povezavi s sladkorno boleznijo tipa I je pripeljal do študij, ki se osredotočajo na kinetiko fibrilacije in strukturne lastnosti. Fibrile inzulina kažejo na lastnosti, ki so skupne vsem amiloidnim vlaknom, to so podolgovata in nerazvejana morfologija, značilen difrakcijski vzorec prečnih β-ploskev ter Tioflavin T fluorescenca. Za boljše razumevanje fibrilacijskega procesa je potreben opis strukturnih podrobnosti vseh oblik in določitev kinetike interkonverzije med posameznimi oblikami tekom reakcijske poti. Zato smo študijo osredotočili na kinetiko fibrilacije inzulina, ki je bila merjena z analizo intenzitet spektralnih vrhov v amidni I regiji infrardečih spektrov, ki so značilni za β-ploskve. Kinetične parametre smo lahko primerjali s tistimi, ki smo jih pridobili s Tioflavin T fluorescenco. Koncentracijske meritve so nakazale, da je hitrost elongacije fibril v skladu z reakcijo prvega reda. Infrardeča spektroskopija omogoča spremljanje strukturnih sprememb, ki se zgodijo med fibrilacijo, in tako omogoča kvantifikacijo individualne strukture znotraj razvijajočega ravnotežja. Opazili smo taljenje α-heliksa in PII konformacije nativnega inzulina in tvorbo β-ploskev. Nizko-frekvenčna spektralna vrhova v amidni I regiji, ki opisujeta β-ploskve, omogočata vpogled v naravo intermolekularnih stikov v fibrilah inzulina in s tem v morfologijo fibril.