REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Cisteinski katepsini so pomembne endosomalne proteaze, primarno udeležene v razgradnjo proteinov. Nekateri izmed njih so dodatno vključeni v specifične biološke procese, kot so na primer razgradnja kostnega matriksa (katepsin K), predstavitev antigenih peptidov (katepsin S) in procesiranje pro-hormonov (katepsina L in V). Povečana aktivnost katepsinov je zaznana v nekaterih patoloških stanjih, kot sta na primer rak in aktivacija virusov. Njihova substratna specifičnost še ni povsem razjasnjena, saj metološki pristopi, ki so na voljo, ne sledijo kompleksnosti njihovega procesiranja. Tega problema smo se lotili s pomočjo statistične analize katepsinskih cepitev, pridobljenih iz obsežne proteomske študije. Izmed vseh cepitev smo izbrali in sintetizirali 30 peptidov, ki predstavljajo raznolikost vseh glavnih klastrov substratov katepsina V. Njihove interakcije s katepsinom V smo preučili v kristalnih kompleksih ter določili njihova cepitvena mesta z divjimi oblikami človeških katepsinov L, K, in V.
Določili smo preko 20 kristalnih struktur kompleksov med katepsinom V in posameznimi peptidi. Strukture smo razdelili v štiri skupine glede na področje vezave peptida oziroma glede na prisotnost cepitve. Interakcije med katepsinom in peptidi so se tvorile na mestih med S4 – S6’. S superimpozicijo struktur smo pokazali, da se preostanki na pozicijah z nenormalno porazdelitvijo preostankov – imenujemo jih heterogene pozicije - vežejo na katepsinska področja, ki so rigidna, in odražajo njihovo specifičnost. Nasprotno se preostanki na pozicijah z normalno porazdeljenimi preostanki – imenujemo jih homogene pozicije – vežejo na fleksibilna področja in nimajo vpliva na specifičnost. Podobno velja za katepsine K, L in S, kar smo ugotovili z analizo že objavljenih kristalnih struktur v bazi PDB. Pomembno je tudi to, da smo uspeli izpostaviti mesta na katepsinih in pripadajoče preostanke, ki ključno prispevajo k specifičnosti katepsina L na mestu P3 in katepsinov L, V in F na mestu P1’. Ta mesta se lahko izrabljajo pri načrtovanju novih specifičnih inhibitorjev katepsinskih endopeptidaz.
Cepitvena mesta peptidov in proteinov z enakim aminokoslinskih zaporedjem niso vselej sovpadala. Primerjava peptidnih kompleksov in edinega že objavljenega kompleksa med proteinom in katepsinom L nakazuje, da prepoznava substrata v aktivnem mestu katepsina ni odvisna zgolj od primarne strukture in afinitete aminokislin do aktivnega mesta, ampak tudi od njene strukture. Procesiranje peptidov zato ne odraža vedno procesiranja proteinov, in obratno.
Poleg tega smo določili kristalno strukturo kompleksa med katepsinom K in inhibitorjem z alkinsko reaktivno skupino. Elektronska gostota inhibitorja nedvoumno potrjuje tvorbo vezi med reaktivnim cisteinom katepsina K in alkinsko skupino inhibitorja, kar prikazuje, da se alkinska skupina lahko uporablja kot šibak in počasen elektrofil za specifično ciljanje tarčnih proteaz. Poleg tega smo pokazali, da so kalpeptin in njemu podobne spojine, ki inhibirajo proteazo Mpro virusa SARS-CoV-2 in preprečujejo njegovo aktivacijo v celičnih linijah, zelo močni inhibitorji človeških katepsinov L, K in V, ter tudi – malo manj močni – katepsina B. To nakazuje, da so morda glavna tarča pri zaviranju virusne aktivacije prav katepsini. Našo tezo smo dodatno podkrepili z določitvijo kristalne strukture kompleksa med katepsinom V in kalpeptinom.