REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Rastlinski virusi so zelo pomembni patogeni mikrobi, saj preko okužb kulturnih rastlin in povzročene bolezni vplivajo na povečanje gospodarske škode in posledično na zmanjševanje kakovosti in količine pridelka. V zadnjih letih so se zaradi razvoja tehnologije visoko zmogljivega sekvenciranja (high throughput sequencing - HTS) povečale možnosti za raziskave in diagnostiko rastlinskih virusov. Slednje pa je omogočilo odkrivanje novih ali manj raziskanih virusov in virusnih različkov ter hitro sekvenciranje njihovih genomov. HTS omogoča sekvenciranje vseh nukleinskih kislin v vzorcu, vendar pa lahko z njim, zaradi popolnoma generičnega pristopa, včasih zaznamo v glavnem bolj zastopane nukleinske kisline gostitelja, obenem pa spregledamo tiste (npr. virusen), ki so manj zastopane, a še vedno pomembne. Da bi rešili to težavo, v različnih laboratorijih uporabljajo različne platforme za sekvenciranje in različne postopke priprave vzorcev. V prvi študiji smo se odločili primerjati dva najpogosteje uporabljena protokola priprave vzorcev za obogatitev virusnih nukleinskih kislin (sekvenciranje malih RNA ter celokupne RNA z odstranjeno ribosomalno RNA) z namenom generičnega zaznavanja rastlinskih virusov in viroidov na platformi Illumina. V študijo smo vključili viruse z različnimi organizacijami genoma in viroide. Vse izbrane viruse/viroide smo zaznali z obema protokoloma; le domnevno nov cytorhabdovirus, ki smo ga zaznali v tej študiji, smo odkrili le z analizo podatkov pridobljenih iz celokupne RNA z odstranjeno ribosomalno RNA. Pridobljeno znanje smo nato uporabili pri raziskavi, v kateri smo iskali viruse v vzorcu paradižnika z neznano etiologijo. Rezultati HTS tega vzorca so razkrili mešano okužbo rastline s tremi različnimi virusi: virusom M krompirja (Carlavirus, Betaflexiviridae), južnim virusom paradižnika (Amalgavirus, Amalgamaviridae) in (prvič na paradižniku in v Sloveniji) novim različkom virusa mozaika zobnika (Potyvirus, Potyviridae). Z uporabo HTS smo v naslednjem koraku prvič sestavili celoten genom virusa mozaika zobnika (HMV). S ponovno inokulacijo okuženega materiala na izbrane testne rastline smo HMV osamili in izvedli analizo nabora gostiteljev. Le ta je pokazala, da virus lahko okuži in povzroči bolezenske znake pri več rastlinskih vrstah, vključno s paradižnikom. S tem smo pokazali uporabnost in dodano vrednost HTS kot diagnostične tehnike. Z naraščajočo potrebo po hitri analizi HTS smo izvedli tretjo študijo, v kateri smo primerjali najbolj uveljavljeno platformo HTS (MiSeq, Illumina) z različnimi protokoli priprave knjižnic ter uporabo manjšega, cenovno ugodnejšega sekvenatorja MinION (Oxford Nanopore Technologies) za detekcijo rastlinskih virusov in viroidov. Primerjave protokolov smo izvedli na petih izbranih vzorcih, ki so vsebovali enajst rastlinskih virusov z različnimi organizacijami genoma in dva viroida. Pri tem smo prvič določili nukleotidno zaporedje viroidov z uporabo sekvenciranja s pomočjo nanopor. Rezultati te študije so pokazali, da se lahko, v primeru izbire primerne priprave knjižnice, sekvenciranje s pomočjo nanopor, uporabi za odkrivanje rastlinskih virusov in viroidov, s podobno učinkovitostjo kot sekvenciranje s tehnologijo Illumina; to pa odpira vrata za implementacijo sekvenciranja s pomočjo nanopor v uradno diagnostiko.