REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Vsakodnevno smo izpostavljeni velikim količinam raznovrstnih nanodelcev, od katerih lahko nekateri resno ogrožajo naše zdravje – izpostavljenost nanodelcem namreč močno prispeva k razvoju pljučnih, srčno-žilnih, in nevrodegenerativnih obolenj. Po nekaterih ocenah izpostavljenost nanodelcem že sedaj skrajša naše življenje za nekaj let, problem pa postaja čedalje bolj pereč zaradi povečane proizvodnje in uporabe novih nanodelcev, ter nastajanja nanodelcev pri uporabi in razgradnji večine materialov.
Precejšen delež škodljivih učinkov nanodelcev lahko pripišemo njihovim majhnim dimenzijam (vsaj ena njihova dimenzija je manjša od 100 nm) in, posledično, ogromni specifični površini, tj. razmerju med površino in maso. Za razliko od večjih delcev lahko nanodelci prečkajo biološke bariere (koža, črevesna stena in pljučni mešički – alveoli) ter preidejo v limfo in kri, od koder se razširijo po celotnem telesu. Največ nanodelcev pride v naše telo skozi pljučne mešičke, saj so ti močno izpostavljeni nanodelcem, imajo veliko površino, razdalja med zrakom in krvjo je v njih zelo majhna, odstranjevanje delcev iz pljučnih mešičkov pa je izredno počasno. V pljučnih mešičkih nanodelci najprej interagirajo s pljučnim surfaktantom – mešanico lipidov in proteinov – nato pa pridejo v stik z izjemno tankimi alveolarnimi epitelijskimi celicami ter alveolarnimi makrofagi (imunskimi celicami pljučnih mešičkov). Ker je večina nanodelcev anorganskega izvora, jih makrofagi ne zmorejo razgraditi, kot to uspešno počnejo s virusi in bakterijami. Večina nanodelcev se zato dolgo časa zadržuje v alveolu, nekaj pa jih preide skozi sloj epitelija v limfo, ter potencialno skozi žilni endotelij v kri.
Trenutno se za določanje možnih zdravju škodljivih lastnosti nanodelcev uporabljajo draga in dolgotrajna testiranja na živalih. Ker na potencialno toksičnost nanodelca vpliva kompleksna kombinacija njegovih lastnosti, je potrebno testirati vsak material posebej, to pa posledično močno omejuje količino testiranih nanodelcev v obtoku. Obetavno alternativo ponuja napovedna toksikologija, ki s pomočjo cenejših in hitrejših visokozmogljivih celičnih testov (t. i. in vitro testov) ciljno preverja zgodnje ključne dogodke, za katere je znano, da vodijo do škodljivih zdravstvenih izidov. Žal ta pristop temelji na poznavanju in razumevanju molekularnih mehanizmov toksičnosti nanodelcev, ki pa je trenutno še vedno zelo pomanjkljivo. Poleg kompleksnosti bioloških sistemov otežuje razvoj razumevanja mehanizmov toksičnosti tudi dejstvo, da je izredno težko primerjati rezultate različnih študij. Že majhne razlike med nanodelci lahko namreč privedejo do popolnoma različnih zdravstvenih izidov. Posledično je potrebno celotno študijo toksičnosti opraviti z isto serijo nanodelcev – od opazovanja zgodnjih dogodkov na mikroskopskih skalah nekaj minut/ur po izpostavitvi, vse do vidnih simptomov na ravni tkiv in organizma nekaj mesecev po izpostavitvi nanodelcem.
Da bi ublažili omenjeno vrzel v znanju o molekularnih mehanizmih toksičnosti in posledično razvili in vitro teste za napovedovanje zdravju škodljivih učinkov vdihnjenih nanodelcev na podlagi poznanih mehanizmov, smo se posvetili odkrivanju in razumevanju zgodnjih molekularnih dogodkov, ki jih povzroči izpostavljenost alveolarnih celic nanocevkam TiO2. Te nanodelce smo izbrali kot modelne nanodelce, ker so predstavniki
skupine široko uporabljenih nanodelcev – titan dioksidnih nanodelcev. Poleg tega omenjene nanocevke močno interagirajo z biološkimi molekulami, zato lahko povzročijo puščanje modelnih lipidnih mehurčkov, razpad celične membrane in celično smrt pri nekaterih celicah, pri miših pa že enkratna izpostavljenost tem nanocevkam povzroči močno nekajmesečno vnetje pljuč.
Pri svojih raziskavah smo uporabljali celični liniji pljučnih epitelijskih celic LA-4 in alveolarnih makrofagov MH-S, katerim smo s fluorescenčnimi sondami označili določene strukture in organele, ter nato opazovali žive celice s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo s prostorskim in časovnim zajemom slike. Svoje ugotovitve smo potrdili s transkriptomiko ter in vivo rezultati (histološkimi rezinami alveolov in bronhoalveolarnimi izpirki miši), pri čemer so bili vsi poskusi opravljeni z isto serijo nanodelcev, zato so medsebojno primerljivi.
Ključen prispevek k razumevanju dogajanja v celicah po izpostavitvi nanodelcem je bil razvoj metodologije za spremljanje položaja in porazdelitve nanodelcev v živih celicah s fluorescenčno mikroskopijo. Za nanocevke TiO2 smo namreč razvili postopek za stabilno, preverljivo in ponovljivo fluorescenčno označevanje nanodelcev s komercialno dostopnimi fluorescenčnimi sondami. Ker smo nanocevke označili s fotostabilnimi sondami z ustreznim emisijskim spektrom, smo lahko poleg tega s superločljivostno STED mikroskopijo določili njihovo lego v strukturah na 50 nm natančno – torej z nekajkrat boljšo ločljivostjo od konfokalne mikroskopije, pri kateri bi bila ločljivost zaradi uklonske limite omejena na približno 300 nm. Za določevanje gostote agregacije nanocevk v vzorcu smo izkoristili dejstvo, da na življenjski čas fluorescence uporabljenih sond vpliva gostota agregatov, kar smo merili z mikroskopijo življenjskega časa fluorescence (FLIM).
Da bi preverili, ali so mehanizmi škodljivosti nanodelcev, katere smo odkrili s fluorescenčno označenimi nanocevkami TiO2, značilni tudi za druge nanodelce, smo le-tem sledili v živih celicah prek detekcije svetlobe, ki se sipa na nanodelcih – torej z uporabo t. i. odbojne mikroskopije. Ker tovrstna detekcija temelji na intrinzični lastnosti urejenih struktur, da sipajo svetlobo, smo lahko z njo sledili katerimkoli nanodelcem brez predhodnega označevanja s fluorescenčnimi sondami.
Ključen rezultat zgoraj opisanega časovnega in prostorskega sledenja nanodelcem v živih celicah je odkritje nanokarantene – novo-opisanega procesa, pri katerem celice pljučnega epitelija izločajo internalizirane nanodelce na svojo površino ter jih pri tem obdajo z lipidi in drugimi biološkimi molekulami. Tako s časom zrastejo veliki bionano-kompoziti na površini epitelijskih celic, ki jih lahko opazimo tudi in vivo v mišjih pljučnih mešičkih. Opažene kompozite smo zaradi njihove značilne oblike, strukture in barve na fluorescenčnih slikah poimenovali »cvetače«. Ker se nanodelci v teh strukturah ne morejo premikati, se s procesom nanokarantene učinkovito zniža aktivna doza (tj. količina nanodelcev v sistemu, ki lahko prosto interagirajo z biološkimi molekulami), kar posledično poveča verjetnost za preživetje celic. Nanokaranteno lahko torej vidimo kot enega od mehanizmov celične obrambe. Pojav nanokarantene smo opazili pri večih vrstah nanodelcev (npr. nanocevkah TiO2, kristaliničnem silicijevem dioksidu DQ12, rutilu TiO2 NM-105, ne pa pri anatazi TiO2 NM-101 ali ogljikovih nanocevkah) in celičnih linijah (pri pljučnih epitelijskih celicah LA-4 in nevronih SH-SY5Y, ne pa pri makrofagih MH-S).
Drugi ključen dogodek za razvoj kroničnega vnetja v alveolu je smrt imunskih celic. Opazili smo, da makrofagi internalizirajo tako proste nanodelce kot tudi nanodelce, katerega so pljučne epitelijske celice že imobilizirale v cvetačah na svoji površini. Makrofagi po internalizaciji razgradijo biološke molekule okoli nanodelcev (t. i. korono), zaradi česar sami sebe izpostavijo nativni površini nanodelca, katera pogosto močno interagira z biološkimi strukturami. Pri posledični smrti makrofaga (opaženi tudi v mišjih alveolih) se internalizirani nanodelci sprostijo v okolico, kjer lahko zopet interagirajo s preostalimi
celicami. Cikel kroženja nanodelcev med epitelijskimi in imunskimi celicami v alveolu je tako sklenjen.
Brez dotoka novih imunskih celic, ki bi nadomestile umrle makrofage, bi se zgoraj opisani cikel kroženja nanodelcev prej ali slej ustavil. V realnem primeru pa pro-vnetna signalizacija (ki je večinoma uravnavana s strani epitelijskih celic) povzroči dotok svežih imunskih celic v alveol, kar lahko privede do neprestanega kroženja nanodelcev med alveolarnimi celicami ter nepretrgane pro-vnetne signalizacije (kroničnega vnetja).
Zgoraj opisano novo-odkrito védenje o ključnih dogodkih v alveolu smo opisali s poenostavljenim teoretičnim modelom. Model vsebuje šest diferencialnih enačb prvega reda za šest spremenljivk (površina nanodelcev v epitelijskih celicah, v cvetačah, v makrofagih, prostih nanodelcev, ter površina epitelijskih in imunskih celic), poleg sedem fiksnih parametrov pa vsebuje tudi tri parametre, ki so specifični za vsako vrsto nanodelcev posebej: toksičnost 𝑡𝑜𝑥, učinkovitost nanokarantene 𝑐𝑓𝑓, in potencial za sprožitev pro-vnetne signalizacije ob nanokaranteni 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑙𝐸𝑓𝑓. S spreminjanjem le-teh v smiselnem območju vrednosti lahko model posnema različne vnetne izide, ki jih opazimo v živo: akutno (prehodno) vnetje, kronično (dolgotrajno) vnetje, in resne poškodbe epitelijskega tkiva. Fazni prostor teh treh parametrov lahko uporabimo za grafično ponazoritev njihovega vpliva na jakost in trajanje vnetja, ter posledično grafično razvrščanje nanodelcev.
Da bi lahko te tri parametre eksperimentalno določili s preprostimi in hitrimi in vitro testi za katerekoli izbrane nanodelce, smo omenjeni teoretični model poenostavili za opis obnašanja monokulture epitelijskih celic, monokulture makrofagov, ter njune kokulture. Iz teh modelov ter meritev nekajdnevnega obnašanja omenjenih treh celičnih sistemov lahko enostavno in hitro določimo ključne tri parametre izbranih nanodelcev, katere nato vključimo v teoretični model dogajanja in vivo, ter s tem računsko napovemo morebitni dolgotrajni vnetni potencial nanodelcev.
Kot je prikazano v tem delu, lahko sledenje celičnim dogodkom in nanodelcem v realnem času v živih celicah v kombinaciji s komplementarnimi pristopi izboljša naše razumevanje mehanizmov nanotoksičnosti, ter tako omogoča razvoj časovno in stroškovno učinkovitega napovedovanja varnosti nanodelcev na osnovi mehanizmov brez testiranja na živalih. Poleg tega pa prikazani rezultati brez dvoma poleg odgovorov na zastavljena vprašanja tudi odpirajo množico novih, razburljivih vprašanj za bodoče raziskave.