REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Ocena genotoksičnosti je pomemben element pri določanju varnosti najrazličnejših snovi, in sicer z namenom, da bi preprečili vpliv številnih kemikalij na zdravje ljudi. Zato je testiranje genotoksičnosti potrebno za vse razrede kemikalij, zdravil in bioloških dejavnikov, ki lahko privedejo do številnih bolezni, vključno z rakom. Posledično se v zadnjih desetletjih vedno bolj spodbuja razvoj novih učinkovitih metod testiranja, saj en sam test ne zadostuje za odkrivanje vseh pomembnih genotoksičnih učinkov; zato je torej za testiranje potrebno uporabiti različne komplementarne tehnike in metodologije. Poleg tega je vse večji poudarek na alternativnih in vitro modelih, ki se osredotočajo na genotoksične učinke kemikalij in onesnaževalcev okolja ter tako znatno prispevajo k zmanjšanju števila živali, ki se uporabljajo v predkliničnih testiranjih.
Trenutno se za ugotavljanje škodljivih učinkov kemikalij uporabljajo tradicionalni in vitro dvodimenzionalni (2D) modeli jetrnih celic. Pojavlja pa se vedno večje povpraševanje po novih pristopih, kar pomeni, da je treba trenutno obstoječe modele izboljšati in nadgraditi, saj pogosto dajejo lažno pozitivne rezultate, kar je posledica manjka pomembnih presnovnih encimov v celicah teh modelov. Zaradi tega se povečuje pomembnost novo razvitih in vitro tridimenzionalnih (3D) celičnih modelov, ki bolj realistično posnemajo vedenje celic in vivo in dajejo natančnejše rezultate v pogojih in vitro v primerjavi z 2D kulturami. Tako novo razviti 3D celični modeli predstavljajo privlačno alternativo poskusom na živalih. Čeprav imajo 3D celični modeli veliko boljših lastnosti od tradicionalnih 2D celičnih modelov, jih je za nadaljnjo uporabo treba standardizirati. Predvsem je treba prilagoditi protokole gojenja in jih ustrezno okarakterizirati, kar bo omogočilo njihovo vsesplošno uporabo na področju genetske toksikologije.
Cilj doktorske disertacije je validirati in optimizirati metodo za testiranje genotoksične aktivnosti kemikalij na jetrnem in vitro 3D celičnem modelu (sferoid), ki smo ga razvili iz dveh človeških hepatocelularnih karcinogenih celičnih linij (HepG2 in HepG2/C3A) z metodo, ki uporablja centrifugalno silo za nastanek sferoidov ter gojenjem sferoidov v statičnem sistemu in v dinamičnem bioreaktorskem (CelVivo BAM/bioreaktor) sistemu. Pokazali smo, da novo razviti 3D celični modeli boljše posnemajo pogoje in vivo kot tradicionalne 2D celične kulture, saj imajo tako izboljšane povezave med celicami in matriksom ter med samimi celicami kot tudi ohranjen in vivo fenotip celic. Pokazali smo, da se v novih jetrnih 3D modelih proliferacija celic zmanjšuje s časom gojenja, v primerjavi z 2D modeli pa je povečano izražanje jetrno specifičnih funkcij in genov, ki kodirajo presnovne encime faze I in II.
V doktorski disertaciji smo nove jetrne in vitro 3D modele, gojene v statičnih in dinamičnih pogojih, uporabili za oceno citotoksičnosti in genotoksičnosti modelnih telesu tujih spojin. V primerjavi z 2D modeli so 3D modeli pokazali večjo stabilnost in živost celic. Z izraženimi lastnostmi 3D modeli omogočajo proučevanje dolgodobne izpostavljenosti različnim spojinam. Pomembnost tega se kaže pri preučevanju genotoksičnih spojin pri nižjih koncentracijah, ki smo jim ljudje vsakodnevno izpostavljeni. Poleg tega so analize na transkriptomski ravni pokazale, da 3D celični modeli izražajo gene, ki so povezani z metabolizmom in lastnostmi jetrnih celic, v večji meri kot 2D modeli, kar kaže na večjo občutljivost za odkrivanje posredno delujočih genotoksičnih spojin.
Z raziskavami smo pokazali, da novo razviti 3D modeli jetrnih celic zaradi svoje bolj zapletene strukture in izboljšane presnovne sposobnosti zagotavljajo primeren eksperimentalni model za študije genotoksičnosti in regulatorno testiranje novih kemikalij in izdelkov. Kljub temu pa je potrebno 3D celične modele nadalje opredeliti in preveriti obnašanje glede delitev celic in odziva na genotoksični stres, da bi bolje poznali vedenje in lastnosti celic v 3D modelu. Novi jetrni 3D modeli nakazujejo možnost premostitve vrzeli med raziskavami in vitro in študijami na živalih.