REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Genetsko zapisani biosenzorji so zmogljiva orodja za raziskovanje rastlinskega imunskega odziva, saj omogočajo sprotno spremljanje obrambnih signalov in vivo z visoko prostorsko in časovno ločljivostjo. S preusmeritvijo s statičnih meritev na dinamične analize časovne dinamike, intenzitete in lokalizacije signalov biosenzorji razkrivajo pomembne značilnosti, ki so ključne za učinkovit imunski odziv.
To delo podaja pregled uporabe biosenzorjev v raziskavah rastlinske imunosti in pri kulturnih rastlinah ter vključuje izvirne eksperimentalne raziskave. Preučevali smo signalizacijo, povezano z jasmonsko kislino (JA) in salicilno kislino (SA) v krompirju (S. tuberosum L.) pri odzivu na napad koloradskega hrošča (L. decemlineata [Say]) in na mehansko ranjenje. Uporabili smo tri dopolnjujoče se biosenzorje: transkripcijski reporter od JA-odvisnega izražanja genov (MC::EYFP), biosenzor prisotnosti JA-Ile, ki temelji na razgradnji JAZ degrona (AtJas9-Venus-N7), ter bakterijski bioluminiscenčni biosenzor za SA (Acinetobacter ADPWH_lux). Biosenzorja JA smo spremljali na intaktnih rastlinah, saj je ločitev lista od rastline onemogočila zaznavo od JA-odvisnih odzivov, kar poudarja pomen in vivo pristopov. Uporabljeni biosenzorji so skupaj omogočili vizualizacijo različnih stopenj signalne kaskade JA ter njihove prostorske povezanosti s kopičenjem SA.
Rezultati uporabe navedenih biosenzorjev so razkrili doslej neopisano prostorsko organizacijo hormonske signalizacije, sprožene z ranjenjem lista. Od JA-odvisno izražanje genov je bilo v celicah neposredno ob mestu poškodbe zavrto, kljub prisotnosti JA-Ile v istem območju. Odziv z JA se je razširil nekaj milimetrov stran od rane v okoliško tkivo, medtem ko se je SA prednostno kopičila ob robu rane. Preprečitev kopičenja SA ter tretiranje z 2,6-dikloroizonikotinsko kislino (INA), ki je analog SA, in z JA so pokazali, da SA zavira od JA-odvisno transkripcijo v celicah v neposredni bližini rane. Ta prostorski antagonizem med SA in JA je bil opažen tako po mehanski poškodbi kot po napadu koloradskega hrošča, pri čemer je bil zavrti pas širši po napadu koloradskega hrošča. V celicah ob robu rane, kjer je bilo od JA odvisno izražanje genov trajno zavrto, je kasneje prišlo do nastanka sekundarne celične stene, kar nakazuje vlogo lokalnega hormonskega antagonističnega delovanja pri celjenju ran in tvorbi zaščitne pregrade pred škodljivci.
Da bi omogočili spremljanje več analitov hkrati, smo sistematično ovrednotili strategije za uporabo več fluorescentnih biosenzorjev v živem rastlinskem tkivu. Izbrano paleto fluorescentnih proteinov smo okarakterizirali glede na svetlost in spektralne lastnosti ter ovrednotili metode za ločevanje prekrivajočih se signalov. Ločitev fluorescentnih proteinov po standardnem večkanalnem slikanju je omogočilo zanesljivo razločitev signalov, pri tem pa tudi skrajšan časa zajema, zmanjšano bledenje in zmanjšan nastanek artefaktov zaradi gibanja. Razviti pristop za segmentacijo pa je omogočil kvantitativno analizo signalov v različnih celičnih razdelkih.
To delo prikazuje, kako genetsko zapisani biosenzorji omogočajo razumevanje prostorsko-časovne dinamike obrambnega odziva pri rastlinah. Opredeljuje zlasti prostorski antagonizem med SA in JA pri odzivu na ranjenje listov. Tovrstni pristopi z genetsko zapisanimi biosenzorji dopolnjujejo omične analize in prispevajo k poglobljenemu mehanističnemu razumevanju rastlinske imunosti, tudi neposredno pri kulturnih rastlinah.