REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Katepsin B je lizosomska cisteinska proteaza, ki ima pomembno vlogo pri različnih
patoloških procesih in zato predstavlja potencialno terapevtsko tarča. To delo obravnava
selektivnost in vezavo sintetičnega mimetika protiteles na osnovi ankirinskih ponovitev
(DARPin) 4m3 na mišji katepsin B (mCatB). Namen je raziskati vrstno specifične
interakcije katepsina B z molekulami DARPin ter pridobiti vpogled v razlike v primerjavi
s človeškim katepsinom B (hCatB), vključno s primerjavo njunih cepitvenih sekvenc z
ostalimi človeškimi katepsini z uporabo gručenja in support vector machine (SVM)
algoritma. Kompleks mCatB–DARPin 4m3 smo potrdili z gelsko izključitveno
kromatografijo (SEC), nano-diferencialno vrstično fluorimetrijo (nano-DSF) in metodo
površinske plazmonske resonance (SPR). Afiniteto 4m3 do mCatB smo določili z metodo
SPR (KD = 65,7 nM), medtem ko smo inhibicijsko konstanto (Ki = 26,7 nM) in način
inhibicije določili s kinetično analizo, ki je pokazala hiperbolično mešano inhibicijo s
pretežno kompetitivnim značajem. V tem delu smo tudi prvič določili kristalno strukturo
mCatB v kompleksu z DARPinom 4m3 z ločljivostjo 1,67 Å. Strukturo kompleksa smo
primerjali s prej objavljenimi strukturami hCatB v kompleksu z DARPinoma 81 in 8h6,
kar je omogočilo vpogled v interakcije, ki bi lahko bile odgovorne za selektivnost.
Strukturna analiza kompleksov je namreč pokazala, da se DARPin 4m3 veže na strukturno
ekvivalentno regijo na mCatB, ki ustreza regiji, na katero se na hCatB vežeta DARPina
8h6 in 81. Ta regija je med katepsini različnih vrst manj ohranjena, pri čemer se je dalo
identificirati aminokislinske interakcije, ki bi lahko prispevale k selektivnosti DARPina
4m3. DARPin 4m3 ni pokazal vezave na hCatB, kar smo potrdili z metodami SEC, nano-
DSF, SPR in inhibicijskimi testi. Analiza cepitvenih zaporedij (P3–P4′) mCatB ter
človeških katepsinov B, K, V, L, S in F z uporabo SVM je pokazala večjo podobnost med
mCatB in hCatB (AUC = 0,73) kot med mCatB in ostalimi človeškimi katepsini (AUC =
0,94 – 0,97). Uporabljeno gručenje substratov mišjega in človeškega katepsina B ter njihova
primerjava z algoritmom SVM predstavljata okvir, ki bi ga bilo mogoče uporabiti tudi pri
drugih proteazah za identifikacijo selektivnih substratov in orodij za selektivno ciljanje.
Rezultati podpirajo funkcionalno podobnost mišjega in človeškega katepsina B, hkrati pa
kažejo, da je mogoče vrstno specifične razlike izkoristiti za selektivno ciljanje. Rezultati
poudarjajo potencial proteinov DARPin kot vrstno selektivnih inhibitorjev katepsina B ter
prispevajo k razumevanju strukturnih osnov interakcij in specifičnosti substratov, ki so
pomembni za razvoj orodij za selektivno ciljanje proteaz.