REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Pljučni rak je med najbolj pogostimi in smrtonosnimi oblikami rakavih obolenj. Le redko je
ozdravljiv, saj je pogosto odkrit v pozni fazi, zato bi zgodnja diagnoza pripomogla k daljšemu
življenju bolnikov. Zaznavanje in določevanje krožečih celic pljučnega raka je pomembno za
zgodnjo diagnozo oziroma za odkrivanje metastazirajočega tumorja, kar bi lahko izboljšalo
prognozo bolezni. V doktorskem delu smo želeli pripraviti aptamere za določanje celic pljučnega
raka kot alternativo protitelesom za prepoznavanje krožečih rakavih celic z lastnostmi matičnih
celic v krvi kot novo orodje za zgodnjo diagnozo in sledenje napredovanja pljučnega raka.
Aptamere so enoverižne DNK ali RNK molekule, sposobne zvitja v tridimenzionalne (3D)
strukture, prilegajoče se tarčnim molekulam. Aptamere so kemijsko sintetizirane, njihova
prednost je v obstojnosti in v veliki specifičnosti in selektivnosti prepoznavanja ter afiniteti do
tarčnih proteinov in/ali celic. Lažje jih tudi modificiramo in konjugiramo v primerjavi s
protitelesi, ki bi bila enako specifična. Z metodo celičnega SELEXa (sistematske evolucije
ligandov z eksponentno obogatitvijo) lahko razvijemo aptamere proti raznim vrstam rakavih celic,
pri čemer tarčne molekule ostanejo v svoji nativni obliki in v izvornem celičnem kontekstu. V
našem delu smo pridobili novo aptamero, ki specifično prepozna celice nedrobno-celičnega
pljučnega raka (NSCLC) in ki izraža tudi površinski označevalec matičnosti CD90.
Tarčna celica za načrtovanje aptamer v procesu pozitivne selekcije sedmih ciklov (krogov)
SELEXa je bila človeška celična linija pljučnega adenokarcinoma A549. Kot negativno selekcijo
smo v zadnjem krogu uporabili protitelesa proteina CD90. Po sedmih krogih selekcije smo izbrali
aptamero A155_18 zaradi močne vezave na celice A549, dobro prepoznavnih strukturnih motivov
in njihove stabilnosti. Tako pridobljene oligonukleotide smo sekvencirali, analizirali z različnimi
bioinformatskimi pristopi ter primerjali z že znano aptamero S6, ki smo jo uporabljali kot
pozitivno kontrolo za vezavo na celice A549. Končna analiza izbora kandidatnih aptamer z
najboljšimi vezavnimi lastnostmi je zatem temeljila na treh neodvisnih bioinformatskih pristopih,
ki pa so pokazali enake sekvence. Na podlagi teh podatkov smo s pomočjo konstruiranega
filogenetskega drevesa prikazali, da sta naši izbrani aptameri A155_18 in S6 strukturno sorodni.
S pomočjo bioinformatskega orodja, imenovanega MEME, smo lahko dokazali, da imata
aptameri dva enaka, specifična motiva, ki se ne pojavljata v ostalih sekvencah kandidatnih
aptamer, izbranih v zadnjem krogu selekcije. Ker je imela primarna celična linija A549 tako
afiniteto do aptamere A155_18 in se je vezala na protitelesa za CD90, lahko sklepamo, da ima ta
linija tudi delne lastnosti matičnosti oziroma kaže na prisotnost subpopulacije z lastnostmi
matičnosti v tej liniji nedrobnoceličnega pljučnega raka.
V doktorski disertaciji smo uspešno razvili novo aptamero A155_18, ki prepozna tarčno celično
linijo pljučnega karcinoma A549, ki izraža tudi biološki označevalec matičnih celic CD90. Naš
pristop je izviren v tem, da smo uporabili in silico selekcijo aptamer s poudarkom na
bioinformatskem predvidevanju sekundarne strukture in teoretičnih fizikalno-kemijskih lastnosti,
kar je omogočilo neposreden izbor najbolj primernega aptamernega oligonukleotida. Poleg
klinične uporabe v diagnozi pljučnega adenokarcinoma je aptamera primerna tudi za nadaljnje
odkrivanje tarčnih proteinov na površini NSCL celic in bi tako lahko prispevala k možnemu
odkrivanju novih bioloških označevalcev pljučnega raka.