REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Glavni problem rutinskega in vitro testiranja genotoksičnosti kemikalij za oceno tveganja genotoksičnosti in kancerogenosti in vivo, ki jo mednarodna zakonodaja v EU zahteva za skoraj vse kemikalije na tržišču, je sorazmerno nizka napovedna moč eksperimentalnih sesalčjih celičnih modelov, ki se v ta namen uporabljajo. To posledično vodi do nepotrebnega in vivo testiranja na živalih ali pa prekinjenega razvoja obetavnih kemičnih izdelkov. Razlog za nizko napovedno moč predstavljajo številne pomanjkljivosti trenutno uporabljanih celičnih modelov, pri čemer je njihova nenormalna presnova ksenobiotikov eden bistvenih dejavnikov. Kot najbolj obetaven pristop pri premagovanju tega problema se je izkazala uporaba celičnih modelov, ki so človeškega izvora, odražajo in vivo metabolizem ksenobiotikov, imajo stabilen kariotip in nespremenjene mehanizme popravljanja DNA poškodb ter se odzovejo na kemikalije z neposrednim in posrednim mehanizmom delovanja. Nekaj človeških celičnih linij, ki izvirajo iz jetrnih tumorjev in so ohranile aktivnost pomembnih presnovnih encimov, se sicer uporablja v in vitro študijah genotoksičnosti, vendar je na trgu na voljo veliko več humanih jetrnih linij, ki se niso nikoli uporabljaje v ta namen in so morda bolj primerne. Ker je večina teh linij rakavega izvora, lahko določene kancerogene lastnosti pomembno vplivajo na njihovo občutljivost in specifičnost v primerjavi z normalnimi celicami in zato je za in vitro testiranje kemikalij potrebno vzpostaviti nove celične modele, ki bodo odražali biotransformacijo kemikalij, primerljivo s primarnimi jetrnimi celicami, in bodo zaznali genotoksične lastnosti kemikalij bolje od celičnih modelov, ki se trenutno uporabljajo.
V prvem sklopu doktorskega dela smo na podlagi celičnih lastnosti, ki so pomembne pri testiranju genotoksičnosti, izmed trenutno razpoložljivih jetrnih celičnih linij človeškega izvora identificirali najbolj primerne. Izbrani sta bili dve rakavi liniji, HepG2 in HuH6, ki imata primerljiv čas proliferacije, izražata nemutirani tumor zavirajoči p53 protein in sta genomsko dokaj stabilni. Obe liniji sta s podobno občutljivostjo zaznali poškodbe DNA, povzročene z modelnimi genotoksini s posrednim delovanjem. Da bi dobili vpogled v metabolne profile obeh celičnih linij, smo izvedli analizo izražanja izbranih jetrno specifičnih transkripcijskih faktorjev in genov, ki sodelujejo pri presnovi ksenobiotikov. Njune metabolne profile smo primerjali z metabolnimi profili primarnih človeških hepatocit dveh darovalcev. Poleg bazalnega izražanja teh genov smo analizirali tudi njihovo inducibilnost po 24-urni izpostavitvi ne-citotoksičnim koncentracijam treh modelnih genotoksičnih kemikalij. S primerjavo presnovnih genskih profilov smo ugotovili, da nobena od rakavih linij ni bolj primerljiva s primarnimi celicami. Z analizo pa smo pojasnili nekatere omejitve presnovnih kapacitet HepG2 in HuH6 celic, kar predstavlja dragocene informacije. Novo pridobljeno znanje je mogoče uporabiti za izboljšavo obeh linij, da bi bili bolj primerni za uporabo v in vitro študijah genotoksičnosti, ali pa za boljše razumevanje in interpretacijo dobljenih rezultatov.
Druga polovica dela je bila namenjena razvoju metabolno aktivnih jetrnim celicam podobnih celic z diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic iz človeškega maščobnega tkiva (hASC). Razen morfologije so diferencirane celice izražale značilne jetrne lastnosti, kot je shranjevanje glikogena in izločanje albumina. Nediferencirane hASC in diferencirane jetrnim celicam podobne celice so se s primerljivo občutljivostjo odzvale na izpostavljenost modelni genotoksični kemikaliji z neposrednim delovanjem (tert-butil hidroperoksid). Izpostavljenost modelnim genotoksičnim kemikalijam s posrednim delovanjem pa pri hASC ni povzročila DNA poškodb, medtem ko so se diferencirane celice odzvale na izpostavljenost kemikalijam B(a)P in AFB1. To pomeni, da smo z diferenciacijo uspeli dobiti metabolno aktivne celice, kar smo potrdili tudi z analizo izražanja metabolnih genov in encimov. Diferencirane celice so izražale ključne encime, ki so bili tudi inducibilni. Diferencirane celice smo takoj po diferenciaciji imortalizirali s transfekcijo s hTERT. Imortalizirane celice so sicer izgubile metabolno kapaciteto, vendar se jih zlahka ponovno diferencira v metabolno aktivne celice, ki se odzovejo na genotoksično aktivnost kemikalij B(a)P in AFB1 s primerljivo občutljivostjo kot ne-imortalizirane diferencirane celice. Imortalizirane celice tako zagotavljajo neomejeno zalogo jetrnim celicam podobnih celic, ki so primerne za rutinsko in vitro testiranje kemikalij.
V doktorski disertaciji smo pokazali, da imajo imortalizirane diferencirane celice številne prednosti, pa tudi, da imata celični liniji HepG2 in HuH6 nekaj omejitev. Vsekakor so vsi trije celični modeli vredni nadaljnjih raziskav v smislu razvoja in vitro testnega modela, ki bi lahko prispeval k zmanjšanju uporabe poskusnih živali in boljši oceni varnosti novih kemičnih izdelkov za učinkovitejše varovanje zdravja ljudi.