REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Razvoj tehnologij visokozmogljivega sekvenciranja (ang. high-throughput sequencing, HTS) nam je ponudil nov in poglobljen vpogled v skrivnosten in očarljiv svet bakterij. Uporabnost teh tehnologij zajema številna področja, ki vključujejo vse od študij celotnih bakterijskih združb do poglobljenih raziskav izbranih bakterijskih izolatov. V tej doktorski nalogi smo na lastnih primerih preverili različne pristope uporabe HTS za preučevanje bakterij. Ti primeri vključujejo uporabo tarčnega HTS za izvedbo metagenomskih študij, sekvenciranje celotnih genomov (ang. whole genome sequencing, WGS) bakterijskih povzročiteljev bolezni rastlin in uporabo genomskih pristopov za načrtovanje novih molekularnih testov za specifično detekcijo tarčnih bakterij.
Tarčni HTS je pogosto uporabljen pristop, ki se uporablja v metagenomiki predvsem za določanje mikrobioma. Vendar na rezultate pogosto vpliva način obdelave vzorcev pred samim sekvenciranjem, pri čemer ima ključen pomen predvsem metoda ekstrakcije DNA. V naši študiji smo preučili vpliv treh različnih metod ekstrakcije DNA na rezultate mikrobioma in rezistoma na primeru vzorcev izpljunka. Ugotovili smo, da metode ekstrakcije DNA pomembno vplivajo na rezultate raznolikosti in sestave mikrobioma in rezistoma iz izpljunka. Kljub tem razlikam so bili rezultati, pridobljeni s tarčnim HTS, ponovljivi. To je poudarilo pomen premišljenega načrtovanja študij v raziskavah mikrobioma, kjer igra izbira ustrezne metode ekstrakcije DNA ključno vlogo. WGS je pogosto uporabljena metoda, ki nam omogoča poglobljeno preučevanje izbranih bakterij. Pri tem pridobljeni podatki se pogosto uporabijo za izvedbo študij primerjalne genomike. V naših raziskavah smo se osredotočili na rastlinski patogen, Pantoea stewartii subsp. stewartii, ki povzroča bakterijsko venenje koruze. Ta karantenska bakterija je bila v zadnjih letih večkrat zaznana tako v Sloveniji kot tudi drugod po Evropi. Da bi razložili te najdbe, smo sekvencirali genome slovenskih izolatov in zgodovinskih izolatov iz zbirk, s katerimi smo nato izvedli študije primerjalne genomike. Te so pokazale, da so slovenski izolati verjetno rezultat vsaj dveh vnosov bakterije, ki niso povezani z najdbami drugod po Evropi, kar nakazuje na več vnosov bakterije. Podatki, pridobljeni z WGS, se lahko uporabijo tudi za razvoj novih molekularnih testov za specifično odkrivanje tarčnih bakterij. Molekularne metode detekcije so še posebej primerne za bakterije, ki jih je težavno gojiti v laboratorijskih pogojih. Primer tovrstne bakterije je povzročitelj bakterijske ovelosti vinske trte Xylophilus ampelinus. V naši študiji smo tako uporabili razpoložljive genomske podatke za razvoj novih testov PCR v realnem času za detekcijo le-tega. V laboratorijskem testiranju smo potrdili primernost treh novih testov za odkrivanje X. ampelinus v različnih vzorcih vinske trte z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in občutljivostjo.
Metode uporabe HTS, opisane v doktorski nalogi, jasno prikazujejo raznolikost te metode. Med njimi so tako bazične raziskave, v katerih lahko HTS uporabimo za razvoj in testiranje novih hipotez, ki se navezujejo na bakterijsko genomiko, biologijo in ekologijo. Drugi bolj praktični načini uporabe se navezujejo predvsem na diagnostiko, kjer se HTS lahko uporablja tako za neposredno analizo vzorcev kot tudi za razvoj novih testov. Vse to zagotavlja nadaljnji razvoj HTS, ki bo ostalo nepogrešljivo orodje na področju bakteriologije.