REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

V večini držav je prisotnost gensko spremenjenih organizmov (GSO) v hrani in krmi strogo regulirana. V Evropski uniji (EU) je prag za označevanje izdelkov, ki vsebujejo odobrene GSO, postavljen pri 0,9 % na sestavino. Hrana in krma, ki vsebuje višji odstotek odobrenih GSO, mora biti primerno označena, medtem ko je prisotnost neodobrenih GSO prepovedana. Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) je zlati standard za določanje in kvantifikacijo GSO, vendar z naraščajočim številom GSO linij postaja časovno in finančno prezahtevna. S povečanim številom odobrenih GSO se povečuje tudi prisotnost neodobrenih GSO. Cilj pričujoče doktorske disertacije je razvoj in karakterizacija metod za kvantifikacijo odobrenih in identifikacijo neodobrenih GSO.
Sestavini, ki jima pripada največ odobrenih GSO linij, sta v EU koruza in soja. Za kvantifikacijo 12 linij GSO koruze in 11 linij GSO soje smo razvili večtarčne teste kapljične digitalne verižne reakcije s polimerazo (ddPCR). Za koruzo tako imenovani 4- in 10-plex ter za sojo 6- in 7-plex. V vseh primerih so bili transgeni označeni z enim fluorescenčnim barvilom, medtem ko je bil endogen označen z drugim barvilom. Na ta način je omogočena kvantifikacija vseh GSO linij znotraj ene sestavine naenkrat. V primeru soje so v procesu avtorizacije še štiri GSO linije. Da bi se izognili potrebi po ponovni karakterizaciji večtarčnega testa vsakokrat, ko bi bila sprejeta še ena linija, smo 7-plex razširili v 11-plex in ga okarakterizirali. Vsi večtarčni testi ddPCR so specifični in v skladu z mednarodno sprejetimi priporočili za testiranje GSO. Dodatno sta bila 6- in 7-plex testirana v medlaboratorijskem testiranju.
Določitev kritičnih faktorjev, ki vplivajo na točnost in natančnost kvantifikacije nukleinskih kislin je izredno pomembna pri testiranju GSO. V primeru ddPCR je kritični faktor volumen kapljice oziroma variabilnost volumna. V medlaboratorijskem testiranju smo primerjali različne generatorje kapljic in različne osnovne zmesi (ang. mastermix). Primerjava je pokazala relevantno razliko med volumnom, ki je predpisan s strani proizvajalca, in izmerjenim volumnom, kar povzroči podcenjevanje števila kopij nukleinskih kislin v reakciji, kadar se zanesemo na izračun, ki nam ga poda programska oprema.
Za namen identifikacije neodobrenih GSO smo razvili prilagojen pristop hoje po genomu, imenovan pomnoževanje linearno obogatenih fragmentov ali ALF (ang. amplification of linearly-enriched fragments). Naš cilj je bil pripraviti delotok, ki omogoča (semi)avtomatizirano analizo podatkov, pridobljenih po sklopitvi ALF, z naslednjimi generacijami sekvenciranja, kar bi omogočalo hkratno identifikacijo tako odobrenih kot neodobrenih GSO. Pristop smo testirali na vzorcu, ki je bil pripravljen kar se da podobno vzorcem, ki jih srečamo v praksi. Vseboval je štiri GSO linije v različnih količinah. Za eno linijo popolno DNK zaporedje ni bilo poznano, ta linija je služila kot neodobren GSO v tej analizi. S pomočjo delotoka smo identificirali zaporedja, ki se ujemajo z zaporedjem neodobrenega GSO,in s tem potrdili princip delovanja tako za ALF kot za delotok.
Razvite metode pa niso relevantne le na področju GSO. Področja, kjer je možno zaznavati več tarč naenkrat kot skupino ali kjer je znan le delček tarčnega DNK zaporedja, na primer v medicini, lahko s prilagoditvami uvedejo novo razvite metode. Poleg tega smo z določitvijo faktorjev, ki odločilno vplivajo na velikost kapljic pri ddPCR, ključno pripomogli k bolj natančnemu določanju števila kopij.