REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Apoptoza je evolucijsko ohranjena oblika programirane celične smrti, ki evkariontom omogoča odstranitev poškodovanih, potencialno nevarnih in odvečnih celic. Kljub dejstvu, da imajo vodilno vlogo v apoptozi kaspaze, so novejše študije pokazale, da so ob zmernih poškodbah lizosomalnih membran v signalizacijo apoptoze udeleženi tudi katepsini. Natančni mehanizmi sprožitve in poteka celične smrti, ki vključuje poškodbe lizosomalnih membran, pa zaradi obstoječih nesoglasij še vedno niso razjasnjeni.
Pokazano je bilo, da so katepsini udeleženi v apoptozi, sproženi s citokinom TNF, vendar obstajajo različna mnenja o njihovem prispevku v apoptotski kaskadi. Nekateri jim pripisujejo vlogo sprožilcev v samem vrhu signalne poti, spet drugi pa jih umeščajo v ojačevalno zanko tekom apoptoze. V prvem delu smo tako preučili vlogo katepsina D (katD) v zunanji poti apoptoze, sprožene s TNFα/cikloheksimidom v celicah človeškega levkemijskega monocitnega limfoma (U937). Ugotovili smo, da se v celicah najprej aktivira kaspaza 8 in pride do cepitve proapoptotskega proteina Bid. Temu sledi permeabilizacija zunanje mitohondrijske membrane (MOMP) in aktivacija apoptosoma ter kaspaze 3. Nastanek in sproščanje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) iz mitohondrijev vodi v permeabilizacijo lizosomalne membrane (LMP), ki predstavlja pozitivno ojačevalno zanko, ki sledi MOMP, kot je bilo tudi nedavno predlagano. LMP povzroči sproščanje katD v citosol, kar je bil v našem sistemu pozen dogodek. Poleg tega apoptoze nismo uspeli preprečiti niti z inhibicijo katD niti z inhibicijo cisteinskih katepsinov. Naši rezultati tako potrjujejo trditev, da LMP in sproščeni katepsini niso potrebni za sprožitev apoptoze, ampak ojačajo apoptotski signal in tako hitro, učinkovito in ireverzibilno posredujejo pri celični smrti. Prvič pa smo pokazali, da ob tretiranju celic U937 s TNFα/CHX pride do razgradnje stefina B, ki je bila neodvisna od katD, delno pa smo razgradnjo preprečili s predinkubacijo celic z antioksidantom N-acetil cisteinom (NAC). Razgradnja stefina B predstavlja dodaten ojačevalni efekt celične smrti, v smislu da progresivne poškodbe lizosomov, ki jih opazimo kot posledico delovanja TNFα/CHX, vodijo v vedno višje koncentracije lizosomalnih cisteinskih katepsinov v citosolu, manjšajo pa se koncentracije njihovih endogenih inhibitorjev (stefin B).
V drugem delu pa smo raziskali vlogo katD v notranji poti apoptoze, sproženi z menadionom, ki predstavlja izvor ROS. Pokazano je bilo namreč, da primerna koncentracija menadiona sproži apoptozo, sam mehanizem poteka tako sprožene apoptotske kaskade in predvsem vpletenost katepsinov v njej pa ostajata nerazjasnjena. Prvič smo pokazali, da pride v celicah U937 ob sprožitvi apoptoze z menadionom do cepitve proapoptotskega proteina Bid ter da so za cepitev odgovorni cisteinski katepsini. Ugotovili smo, da se aktivirata obe sprožitveni kaspazi 8 in 9, pride pa tudi do cepitve proteina PARP. Z uporabo inhibitorjev proteaz smo tudi v primeru apoptoze, sprožene z menadionom, ovrgli ključno vlogo katD in cisteinskih katepsinov pri tem procesu. Ugotovili pa smo, da pride do cepitve stefina B tudi v apoptozi, sproženi z menadionom, kar smo preprečili s predinkubacijo celic s splošnim kaspaznim inhibitorjem z-VAD-FMK ter delno z inhibitorjem katD, PepA-P.