REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Povzročitelji bolezni rastlin so vzrok za znatne ekonomske izgube. Razumevanje mehanizmov odgovora rastlin na škodljivce je ključno za pridobivanje odpornih genotipov. V prvem delu doktorata smo preučevali promotorje iz različnih genotipov krompirja, ki so vključeni v regulatorno omrežje imunskega odgovora. Te bi v naslednjem koraku lahko uporabili za pripravo specifičnih senzorjev signalizacije v imunskem odgovoru, kar bi omogočilo natančno spremljanje prostorsko-časovne dinamike tega procesa. Poravnave nukleotidnih zaporedij promotorjev izbranih genov, vključenih v rastlinsko hormonsko signalizacijo, so pokazale veliko variabilnost tako med genotipi, kot tudi znotraj istega genotipa. Prav tako smo v promotorjih izbranih genov z analizami in silico določili različne regulatorne elemente, ki se aktivirajo ob napadu povzročiteljev bolezni. Promotorje z ustrezno kombinacijo regulatornih elementov smo sklopili s fluorescenčnimi proteini in njihovo aktivnost določili po prehodni in stabilni transformaciji. Za pripravo senzorja, ki bi omogočal sočasno spremljanje aktivnosti več promotorjev, je potrebno v rastlinski genom vnesti različne kombinacije fluorescenčnih proteinov pod kontrolo različnih promotorjev. Ker je kloniranje več fragmentov DNA še vedno eden od tehnoloških izzivov v rastlinski sintezni biologiji, smo razvili Plant X-tender, ki vsebuje komplet rastlinskih ekspresijskih vektorjev in protokole za učinkovito kloniranje večgenskih konstruktov v pripravljene vektorje. Vektorji predstavljajo prazna ogrodja z različnimi selekcijskimi markerji, kar omogoča popolno fleksibilnost pri načrtovanju konstruktov. Poleg tega vsebujejo kaseto ccdB, ki omogoča preprost in učinkovit prenos večgenskih konstruktov v pripravljene vektorje. Metodo smo validirali z izražanjem genov po vnosu večgenskega konstrukta s prehodno transformacijo. V tretjem delu doktorske disertacije smo preučevali vlogo celične smrti v s preobčutljivostnim odzivom pogojeni odpornosti na okužbo s krompirjevim virusom Y pri krompirju. Pokazali smo, da se v rastlinah krompirja, pri katerih je preobčutljivostni odziv pogojen z genom Ny-1 (sorta Rywal), virus nahaja izven območja celične smrti, kar smo opazili kot posamezne okužene celice ali majhne skupke okuženih celic. Potrdili smo, da celice na meji območja celične smrti vsebujejo virus, ki lahko povzroči ponovno okužbo. Nadalje smo preučevali dinamiko širjenja območja celične smrti in pojavljanje okuženih celic izven tega območja. Odziv v rastlinah krompirja sorte Rywal po okužbi z virusom smo primerjali z odzivom v rastlinah krompirja, pri katerih ne pride do kopičenja salicilne kisline. V teh rastlinah pride do pojava lezij, širjenje virusa pa ni omejeno. Pokazali smo prisotnost virusa izven območja celične smrti v vseh razvojnih stopnjah nekrotičnih lezij. Opazili smo hitro širitev lezij in še hitrejše širjenje virusa v rastlinah, pri katerih ne pride do kopičenja salicilne kisline. Poleg tega se večina analiziranih lezij počasi razširja tudi v rastlinah, pri katerih je odpornost pogojena s preobčutljivostnim odzivom, kar odpira možnost, da grejo okužene celice sčasoma v celično smrt. Rezultati kažejo na to, da je celična smrt v preobčutljivostnem odgovoru ločena od mehanizmov odpornosti, ki vodijo do zaustavitve širjenja krompirjevega virusa Y v genetskem ozadju Ny-1. Predlagamo, da se s preobčutljivostnim odzivom pogojena odpornost obravnava kot proces, pri katerem je dinamika dogodkov ključna za učinkovitost zaustavitve širjenja virusa.