REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Cisteinski katepsini v številnih primerih vnetnih bolezni pripevajo k razvoju in napredovanju bolezni, a natančna vloga posameznih katepsinov ni vedno jasna. Pri boleznih kot so rak, vnetne bolezni sklepov in ateroskleroza, so najpomembnejši katepsini B, K, L in S. Za te encime je v zdravih tkivih značilna endolizosomalna lokalizacija, medtem ko se po indukciji vnetja katepsini delno translocirajo na področje celične membrane ter v zunajcelični prostor, poleg tega pa se njihovo izražanje in aktivnosti povišajo.
V okviru doktorskega dela smo se osredotočili na pripravo novih orodij za spremljanje lokalizacije katepsinov B in S in vivo, kar bi omogočilo karakterizacijo njune vloge pri boleznih. Ta pristop ima tudi pomembno translacijsko vrednost v medicini, saj lahko z optičnim slikanjem diagnosticiramo bolezni, za katere je značilno povišano izražanje tarčnega proteina. V primeru katepsinov je bil razvoj selektivnih sond v preteklosti otežen zaradi visoke strukturne podobnosti med encimi te družine.
Pri našem delu smo se osredotočili na dve novi tehniki, ki sta nam omogočili pripravo selektivnih orodij za diferenciacijo med temi zelo ohranjenimi tarčami.
Katepsin B smo specifično tarčili z malimi vezavnimi proteini DARPini, za katere je značilno prepoznavanje velikih tridimenzionalnih epitopov na površini tarčnih proteinov. Razvili smo DARPin 8h6, ki se z visoko afiniteto veže na katepsin B na strukturno heterogeno območje v družini katepsinov. Fluorescentno označeni DARPin 8h6 se je vezal s katepsinom B na površini tumorskih celic in makrofagov ter v vnetnem mikrookolju v dveh mišjih modelih raka mlečne žleze in v modelu artritisa, kar kaže na možnost uporabe tega DARPina za spremljanje lokalizacije katepsina B. Zaradi hitrega izločanja presežnih koncentracij DARPina iz krvnega obtoka smo v zelo kratkem času po sistemski administraciji v miših zaznali visok kontrast na območju tumorja oziroma artritisa, kar kaže na potencial pri razvoju DARPina kot diagnostičnega orodja za vnetne bolezni. Pri vezavi na katepsin B DARPin 8h6 delno zasede tudi aktivno mesto katepsina B, zaradi česar inhibira njegovo encimsko aktivnost, kar bi v prihodnosti lahko omogočilo tudi terapevtske ali teranostične aplikacije.
V drugem delu doktorata smo selektivno tarčili katepsin S s pametnimi substratnimi sondami, ki smo jih razvili na osnovi reverznega pristopa. Ta metodologija temelji na pretvorbi znanega selektivnega inhibitorja z dobrimi farmakološkimi lastnostmi v fluorescentni substrat, pri čemer se z veliko verjetnostjo ohranjanja selektivnost za tarčni encim. Selektivno substratno sondo 2 smo nadalje modificirali z lipidno oziroma polimerno skupino za izboljšanje in vivo tarčenja. Ugotovili smo, da konjugacija sond ni spremenila selektivnosti za katepsin S ali znižala procesiranja v celičnem modelu diferenciranih makrofagov, kar kaže na možnost uporabe sond v predkliničnih raziskavah bolezni kot tudi za diagnostične namene.