REPOZITORIJ > REZULTATI

Povzetek

Z naraščanjem števila svetovnega prebivalstva narašča tudi potreba po vedno večji in bolj učinkoviti pridelavi hrane, kar zahteva vedno bolj osredotočena prizadevanja po izboljšanju lastnosti agronomsko pomembnih rastlin. Male RNA molekule so se v zadnjem času pojavile kot obetavno orodje za uporabo v genskem inženiringu za izboljšanje donosa pridelka. Manipulacija specifičnih malih RNA lahko namreč izboljša odziv rastline na različne stresne pogoje v okolju, vključno z učinkovitejšim imunskim odzivom proti povzročiteljem bolezni. Virus krompirja Y (PVY) velja za enega izmed glavnih povzročiteljev bolezni na krompirju, ki povzroča velike gospodarske izgube v svetovni pridelavi krompirja. Naš cilj je bil razkriti regulacijo malih RNA in njihovo vlogo v kompleksni imunski signalizacijski mreži tolerantnih (cv. Désirée in cv. Pentland Squire) in odpornih (cv. Rywal) rastlin krompirja na okužbo s PVY. Z uporabo visokozmogljivega sekvenciranja smo odkrili več kot 200 anotiranih mikro RNA (miRNA) molekul, 199 novih miRNA molekul ter več kot 9000 faznih malih interferenčnih RNA (phasiRNA) molekul. S primerjavo profilov izražanja teh krompirjevih malih RNA med okuženimi in zdravimi vzorci in primerjavo profilov izražanja njihovih tarčnih transkriptov smo povezali odzive malih RNA s fiziološkimi procesi. Poleg že odkrite regulacije R genov smo pri tolerantnih rastlinah krompirja Désirée odkrili novo povezavo med malimi RNA in regulacijo giberelinske signalizacije. Po okužbi s PVY se je povečalo izražanje dveh krompirjevih malih RNA, miR167e in phasiRNA931, kar je vodilo v zmanjšanje količine transkriptov, ki kodirajo encime za sintezo giberelinov, ter zmanjšano koncentracijo samih giberelinov. Pokazali smo, da je regulacija odvisna od prisotnosti salicilne kisline. Regulatorni nivo miR167e in phasiRNA931 je bil namreč po okužbi z virusom nižji v transgenih rastlinah z zmanjšano sposobnostjo akumulacije salicilne kisline (NahG-Désirée). S primerjavo profilov izražanja malih RNA po okužbi s PVY med obema tolerantnima genotipoma krompirja smo odkrili šest skupnih podobno reguliranih malih RNA molekul. Za eno izmed njih, miR390a, smo pokazali, da njeno povečano izražanje predstavlja dodatno zanko za zmanjšanje giberelinske signalizacije, kar lahko vodi k boljšemu imunskemu odzivu. Pri odpornih rastlinah krompirja cv. Rywal smo našli številne prostorsko regulirane male RNA, katerih tarče so predvsem transkripti imunskih receptorjev. Prav tako smo za miR398c pokazali, da je pomembna za vzdrževanje homeostaze reaktivnih kisikovih zvrsti pri s preobčutljivostnim odzivom pogojeni odpornosti sorte Rywal na virus PVY. V okviru disertacije smo optimizirali protokol za analizo izražanja malih RNA v homogeniziranem rastlinskem materialu z uporabo metode RT-qPCR. Pokazali smo, da protokol deluje in da se lahko uporablja za validacijo sekvenčnih podatkov. Poleg tega smo vzpostavili protokol za hkratno izolacijo kratkih in dolgih RNA molekul iz majhnih koškov rastlinskega materiala, ter protokol za odstranjevanje DNA in čiščenje RNA. Protokola omogočata dobro kvaliteto in izplen ter se lahko uporabljajata za analize malih RNA in dolgih RNA molekul z uporabo metode RT-qPCR ali metode sekvenciranja. Optimizirali smo tudi bioinformatski protokol za napoved miRNA molekul in njihovih lokusov z uporabo orodja ShortStack. ShortStack omogoča strogo in zanesljivo napoved ter zmanjšuje potrebo po uporabi dodatnega orodja, s čimer lahko bistveno skrajšamo čas analiz.